تاریخچه کروماتوگرافی

 کروماتوگرافی، یکی از جذابترین و پرکاربردترین کاربردهای علم شیمی در صنایع مختلف می باشد که قدمتی بیش از صد سال دارد و برای نخستین بار توسط دانشمند ایتالیایی تبار روسی در سال 1900 میلادی به جهان علم عرضه  شد.

 

اساس کار در انواع روش های کروماتوگرافی 

اساس کار جداسازی نمونه توسط انواع متدهای کروماتوگرافی، رقابتی است که بین فاز ساکن و فاز متحرک بر سر جذب آنالیت، شکل می گیرد. به این صورت که وقتی نمونه (شامل چند جزء) وارد یک سیستم کروماتوگرافی می گردد، اجزایی که تمایل کمتری به فاز ساکن دارند، سریعتر، و اجزائی که تمایل بیشتری به فاز ساکن دارند، دیرتر از سیستم کروماتوگرافی خارج میگردند و بدینوسیله از هم جدا  می شوند.

 همان طور که در شکل فوق مشاهده میکنید نمونه زرد رنگ از دو جزء قرمز و سفید تشکیل شده که فاز متحرک در جهت فلش های قرمز رنگ، سعی دارد هر دو جزء سفید و قرمز  را از روی فاز ساکن عبور داده و از سیستم کرومانوگرافی خارج نماید، ولی فاز ساکن مانع از اینکار میگردد و با جذب اجزاء نمونه زرد رنگ به سمت خود سعی دارد آنها را در سیستم نگهدارد، با این حال همان طور که مشاهده می کنید فاز ساکن، قدرت کمتری در جذب جزء سفید رنگ نسبت به جزء قرمز رنگ دارد و فاز متحرک موفق شده جزء سفید رنگ را سریعتر از جزء قرمز، از سیستم خارج نماید .البته نهایتا فاز متحرک موفق می گردد هر دو جزء سفید رنگ و قرمز رنگ را از سیستم خارج کند، ولی خارج شدن آنها بصورت جدا از هم خواهد بود، و این اساس علم کروماتوگرافی است.

 

کروماتوگرافی مایع HPLC

از میان تکنیک‌های جداسازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است و سالیانه میلیون‌ها دلار صرف خرید و فروش دستگاه‌های HPLC در دنیا می‌شود. علت این رشد را می‌توان به حساسیت بالا،حجم کم آنالیت، تکرار پذیری بالا، تعیین غلظت آنالیت با صحت بالا و قابلیت آنالیز نمونه‌های غیرفرار و حساس به دما که با تکنیک GC (کروماتوگرافی گازی) امکان‌پذیر نیستند، نسبت داد. انتخاب فاز متحرک و ثابت، انتخاب آشکارساز و تعیین سرعت جریان فاز متحرک از جمله موارد اساسی در تنظیمات یک روش مناسب HPLC است.

اساساً سیستم های کروماتوگرافی مایع چهار نوع اند:

1. کروماتوگرافی تقسیمی

2. کروماتوگرافی جذب سطحی

3. کروماتوگرافی یونی

4.  کروماتوگرافی ژلی.

 در بین این چهار نوع، روش کروماتوگرافی تقسیمی بیشتر از همه کاربرد دارد. کروماتوگرافی تقسیمی خود به دو نوع تقسیم می گردد :

• مایع-مایع : که در فاز ساکن مایع روی سطح ذرات پرکننده به وسیله جذب سطحی فیزیکی نگه داشته می شود.

• فاز-پیوندی : که فاز ساکن به صورت شیمیایی به سطح ذرات متصل شده است. به دلیل معایب کروماتوگرافی مایع- مایع مانند هدر رفتن فاز ساکن از طریق حل شدن در فاز متحرک، و عدم امکان استفاده در شویش های شیبی (gradient)امروزه از روش فاز-پیوندی استفاده می گردد.

تقریباً تمام پرکننده های فاز-پیوندی از جنس سیلیس یا ترکیبات بر پایه سیلیس تهیه می شوند. هر گاه فاز ساکن پیوند داده شده قطبی باشد، اصطلاحا به آن فاز نرمال؛ و اگر ناقطبی (اغلب یک هیدروکربن) باشد به آن فاز معکوس می گویند.

امروزه شاید سه چهارم تمام کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا با ستون های حاوی پرکننده های فاز-معکوس انجام می شود که اکثراً گروه R در سیلوکسان آنها، یک زنجیر C8 یا C18 است. از ستون های فازنرمال می توان به ستون هایی اشاره کرد که گروه  Rدر سیلوکسان آنها گروه عاملی قطبی مانند سیانو با قطبیت کمتر و انواع گروه آمینو با بیشترین قطبیت می باشند.

فاز ساکن و فاز متحرک

در مورد قطبیت فاز‌های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد. طبق این قاعده، قطبیت حل‌‌شونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروه‌های عاملی در ترکیبات به صورت زیر است: 

هیدروکربن < اترها < استرها < کتون‌ها < آلدئیدها < آمیدها < آمین‌ها < الکل‌ها

خصوصیات فاز متحرک در HPLC در زیر آمده است:

• درصد خلوص بالا (حلال‌هایی با درصد خلوص بسیار بالا، HPLC Grade، در بازار موجود است که قیمت بالایی نیز دارد(

•  نقطه جوش بالاتر از دمای ستون (به خصوص در مواردی که با گرمکن (Oven) کار می‌شود(

• واکنش‌پذیری کم (Inertness)

• قابلیت تطابق با آشکارساز

اجزاء و قسمت‌های مختلف دستگاه  HPLC

دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمت‌های مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره می‌شود:

مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلال‌های شستشودهنده ستون ریخته شده است.

 

موتور یا پمپ: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون، نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می‌شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می‌شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد.

تزریق‌کننده (Injector):تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می‌گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می‌گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم‌افزار) می‌دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می‌شود. در روش دستی، از سرنگ‌هایی با ظرفیت‌های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می‌شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه‌بردار (Loop) بستگی دارد و مقدار آن معمولاً در حد 5 تا 500 میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس از آماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می‌شود.

ستون: پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش‌ستون (pre-column) یا ستون محافظ (Guard column) می‌شود طول این ستون معمولا در حد سانتی‌متر بوده و جنس آن از فولاد ضد زنگ می باشد. ماده پر کننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پر کننده ستون اصلی است. ستون محافظ  با حذف ناخالصی های موجود در حلال ها و اجزای نمونه، باعث افزایش عمر ستون اصلی می شود.

ستون می‌تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از مرسوم‌ترین ستون‌های غیرقطبی می‌توان به C18، اکتادسیل سیلان (ODS) اشاره کرد. جنس ستون‌ها از فولاد ضدزنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، براساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمان‌های متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکارساز(Detector) هدایت می‌شود.

آشکارساز (Detector): آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می‌شود. آشکارسازها انواع مختلفی دارند که از پرکاربردترین آنها می توان به : آشکارسازجذبی ماوراء بنفش-مرئی(UV/VIS), آشکارساز ضریب شکست,آشکارساز فلورسانس,آشکارساز الکتروشیمیایی وآشکارساز طیف‌سنج جرمی (MS) اشاره کرد. به طور کل یک آشکارساز خوب باید دارای ویژگی‌های زیر باشد:

• حساسیت بالا

• غیرتخریبی بودن (Nondestructive): در طول روند شناسایی، نمونه را تخریب نکند.

• پاسخ خطی به غلظت در دامنه وسیع (برای سهولت در محاسبات)

آشکارسازجذبی ماوراء بنفش-مرئی

آشکارسازجذبی ماوراء بنفش-مرئی متداول ترین آشکارساز مورد استفاده در HPLC است  که در این آشکارساز فاز متحرک خروجی از ستون وارد یک سل کوچک می شود ,اختلاف شدت جذب نور وقتی که فقط فاز متحرک عبور می کند و وقتی همراه با نمونه عبور داده می شود نشان دهنده ی میزان  غلظت نمونه است.

این آشکارسازانتخابگربوده وفقط می تواند اجزای نمونه ای که نور مرئی / ماوراء بنفش را جذب می کنند آشکار سازد.

کاربردهای کیفی

آنالیز کیفی، برای تشخیص و شناسایی نوع ترکیبات انجام می‌شود. از آنجایی‌که زمان بازداری (Retention Time) برای هر ماده در یک سیستم و شرایط خاص آزمایشگاهی ثابت و مشخص می‌باشد، می‌توان از آن درجهت تعیین نوع آنالیت استفاده کرد. به این منظور کروماتوگرام آنالیت را در طول موج آن آنالیت با کروماتوگرام به‌دست آمده از استاندارد آن آنالیت در همان طول موج مقایسه می‌کنند, در صورت یکسان بودن زمان بازداری می‌توان با قطعیت نوع ماده را تعیین کرد. ذکر این نکته لازم است که مقایسه این دو کروماتوگرام تنها در شرایط آزمایشگاهی و دستگاهی کاملاً یکسان معتبر است.

 

آنالیز کمی

به‌منظور تعیین کمی مقدار آنالیت، سطح زیر پیک و یا ارتفاع پیک ترکیب مجهول را با نمونه استاندارد مقایسه می‌کنند. در مواردی که پیک‌ها باریک و متقارن باشند، اندازه‌گیری ارتفاع پیک از صحت و سرعت بیشتری برخوردار است.

 

روش هایی جهت کنترل کیفی

1) روش استاندارد خارجی (External Standard):

در این روش، محلول‌هایی با غلظت‌های مختلف از استاندارد (استاندارد آنالیت مورد نظر) ساخته شده و سپس بر اساس ارتفاع یا سطح زیر پیک بدست آمده از کروماتوگرام این استانداردها، منحنی کالیبراسیون (منحنی ارتفاع و یا سطح زیر پیک، بر حسب غلظت) رسم می‌شود. با استفاده از معادله خط بدست آمده، مقدار ارتفاع و یا سطح زیر پیک نمونه مجهول، مقدار دقیق آنالیت محاسبه می‌شود.

2) روش افزایش استاندارد (Standard Addition):

در این روش ابتدا ماده مجهول، آنالیز می‌شود، سپس به چند ظرف که حاوی مقدار یکسانی از نمونه است، حجم‌های مشخصی از استاندارد اضافه می‌شود و کروماتوگرام مربوط به هر مرحله را آنالیز و در نهایت ارتفاع یا سطح زیر پیک نمونه‌ها را بر اساس حجم استاندارد اضافه شده رسم می‌کنند. در نهایت با استفاده از روابط موجود می‌توان غلظت نمونه را محاسبه کرد.  با این روش احتمال مزاحمت بافت (Matrix Interference) نمونه از بین برده می‌شود.

3)استاندارد داخلی (Internal Standard):

دو نوع خطا (سیستماتیک و تصادفی) در سیستم موجود است. برخی از این منابع ثابت را می‌توان با اضافه کردن یک استاندارد داخلی به نمونه‌ها و تقسیم ارتفاع پیک یا سطح زیر پیک مربوط به هر آنالیت بر همین مقادیر مربوط به استاندارد داخلی، حذف کرد. در انتخاب استاندارد داخلی باید به شباهت‌های ساختاری آنالیت با جزء انتخابی، نزدیک بودن زمان بازداری پیک آن به پیک نمونه و ...، توجه کرد. با انتخاب یک استاندارد داخلی مناسب می‌توان خطا را از 1 تا 2 درصد به 0.5 تا 1 درصد کاهش داد.

 

نتیجه گیری کلی

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، روشی مناسب جهت جداسازی، اندازه‌گیری، و تعیین نوع مواد است. این تکنیک در تلفیق با روش‌های دیگر و آشکارسازهای پیشرفته‌ای مانند طیف‌‍سنج جرمی کاربردهای زیادی در علوم مختلف دارد.

 

زمینه کاربردی

• فارماکولوژی(صنایع دارویی) : به منظور بررسی تطابق محصولات با استانداردها وشناسایی داروهای جدید

• آزمایشگاهای تشخیص طبی : به منظورآنالیز آمینو اسیدها، پروتئین ها، کربوهیدراتها، لیپیدها، نوکلیئک اسیدها و ترکیبات وابسته به آنها و همچنین ویتامین های محلول در آب وچربی وتشخیص دز دارویی در نمونه های بیولوژیک مانند خون، ادرار و سایر مایعات بدن.

• صنایع غذایی : آنالیز باقیمانده سموم و حشره کش ها، آنالیز پروتئین ها، ویتامین ها و تشخیص تقلب در مواد غذایی

• محیط زیست : آنالیز انواع آلاینده های محیطی در آب و پساب