تشخیص الگوهای آزمایش ANA با تکنولوژی ایمونوفلورسانس غیر مستقیم (بخش دوم)

| تعداد بازدید : 3120

آزمایش های جدید ایمونوفلورسانس غیر مستقیم، امکان بررسی همزمان حداکثر 45 نوع اتو آنتی‌بادی‌های ضد هسته(ANAs)   در شکل های میتوکندریال، سیتوپلاسمیک، هسته ای و میتوزی، ‎ با دقت و صحت  نزدیک به ۱۰۰ درصد  را ممکن می سازد. با این روش جدید تشخیصی می توان ‎ تمام آنتی‌بادی‌های  گروه ANA و تشخیص افتراقی  و احتمالی بیماریهای  اتوایمیون  مربوطه را تشخیص داد. 

تشخیص الگوهای آزمایش ANA با تکنولوژی ایمونوفلورسانس غیر مستقیم (بخش دوم)

آزمایش ANA  ؛ الگوهای هموژنوس هسته ای ؛ Nuclear Homogeneous  (AC-1)

آزمایش ANA  انجام شده با سلول‌های HEp-2 فلورسانس هموژنوس از هسته سلول را نشان می‌دهند. کروموزوم‌های متراکم شده در سلول‌هایی که در فاز میتوز هستند کاملاً برجسته و متمایز می‌باشند. در این سلول‌ها اطراف کروموزوم‌ها فلورسانس حداقلی دارد.

در سلول‌های کبد میمون ، یک گسترش فلورسانس خوشه‌ای یک‌دست و نسبتاً متراکم (Coarse) تا ملایم (Fine) در هسته سلول قابل مشاهده است.آنتی‌ژن‌های هدف در آزمایش ANA ، الگوی فلورسانسی هموژنوس dsDNA و ssDNA ، هیستون‌ها  و نوکلئوزوم ها می‌باشند.

 

 

آزمایش ANA ؛ اتو آنتی بادی ضد  dsDNA

سوبسترای استاندارد برای آزمایش ایمنوفلورسانس تشخیص آنتی dsDNA استفاده از تک‌یاخته Hemoflagellates Crithidia Luciliae می‌باشد.این تک‌یاخته برای ردیابی آنتی بادی ضد dsDNA  ، یک کینتوپلاست یا میتوکندریون بزرگ حاوی dsDNA دارد که این ترکیب در هسته تک‌یاخته وجود ندارد.

آنتی‌بادی‌هایی که به کینتوپلاست متصل می‌شوند منحصراً با dsDNA این ارگانل سلولی ترکیب می‌شوند و یک فلورسانس نسبی، هموژنوس و برجسته در کناره تک‌یاخته را نشان می‌دهد. هرگونه واکنش فلورسانس در آزمایش dsDNA  مربوط به هسته و بازال بادی فلاژل تک‌یاخته هیچ ارزش تشخیصی ندارد. آنتی‌بادی ضد ssDNA نمی تواند کینتوپلاست را فلورسانس کند.

کاربرد بالینی اتوآنتی‌بادی ضد dsDNA منحصراً در SLE و در 60 تا 90 درصد موارد بسته به روش تشخیص و فعالیت و پیشرفت بیماری قابل تشخیص است.

 

 

آزمایش ANA  ؛  الگویDens Fine Speckled 70 (DFS70)(AC-2)

اتوآنتی‌بادی ضد آنتی‌ژن DFS70، در آزمایش ANA  با سلول های HEp -2 شکلی از الگوی هسته‌ای هموژنوس  با نمای Dens Fine Speckles را نشان می‌دهد که کروماتین در سلول‌های HEp-2 در مرحله متافاز فلورسانس گرانولار دارد.

آنتی‌ژن هدف: در آزمایش ANA  مثبت با الگوی DF-S70 آنتی‌ژن‌های اختصاصی هسته‌ای DFS70 یا »Lens؛ Lens Epithelium-Derived Growth Factor است.

کاربرد بالینی: اتوآنتی‌بادی ضد DFS70 در بیماری‌های متفاوتی چون درماتیک آتوپیک، آسم، سیستیت اینترسنشیال روماتوئید و برخی از اهدا کنندگان سالم خون دیده می‌شود. این اتوآنتی‌بادی در بیماری‌های اتوایمیون سیستمیک با شیوع کم دیده می‌شود ولی هرگاه در  بیماری آزمایش ANA با الگوی DFS70 مثبت شد باید با روش های تاییدی ELISA  یا Line Blot آن را تائید نمود.  اخیراً این آنتی‌بادی در حدود 11%موارد بیماری‌های روماتوئید ردیابی شده است.

 

 

 

آزمایش ANA ؛ آنتی‌بادی علیه سانترومرها (AC-3) 

در حضور آنتی بادی ضد سانترومر سلول‌های HEp-2 یک الگوی بسیار اختصاصی فلورسانس با ویژگی‌های گرانول‌های ریز با اندازه‌های مختلف (46 تا 92 سانترومر در هر سلول) را نشان می‌دهد. گرانول‌ها در سلول‌های فاز اینترفاز در کل سلول‌ها پراکنده‌اند ولی در سلول‌های فاز میتوتیک به صورت نواری در مرکز یا دو باند نواری به موازات هم نزدیک سانتریول‌ها مشاهده می‌شوند. در برش سلول‌های کبد میمون10 تا 20 گرانول فلورسانس در تمام سلول پراکنده است. فلورسانس این گرانول‌ها به مراتب نسبت به سلول‌های HEp-2 کم‌تر می‌باشد. سلول های میتوتیک به ندرت در بافت کبدی قابل مشاهده است.

آنتی‌ژن هدف: در آزمایش ANA  علیه سانترومرها آنتی‌ژن‌های اختصاصی CENT -A  وCENT -B  می باشند.

کاربرد بالینی: آزمایش ANA  مثبت با الگوی فلورسانس سانترومری در 80 تا 95 درصد موارد سیستمیک اسکلروز پیشرونده (فرم limited) قابل ردیابی بوده و برای این بیماری پاتو گنومونیک است . در فرم محدود شده بیماری اندام های انتهایی بیشتر از اندام های داخلی درگیر می شوند.

 

 

آزمایش ANA ؛ اتوآنتی‌بادی ضد نوکلئوپلاسم/گرانولار ملایم؛ Nucleoplasm/ Fine Speckled  (AC-4)

در این الگو سلول‌های HEp-2، فلورسانس  Speckled یا گرانولارملایم (Fine speckled) که در تمام سطح سلول به طور یکنواخت گسترش دارد را نشان میدهند. هستک‌ها فلورسانس خفیفی دارد و به صورت سایه‌ای در نوکلئوپلاسم خود را نشان می‌دهد.در برخی نمونه‌ها هستک‌ها هیچ گونه فلورسانسی ندارند.سلول‌های میتوتیک فلورسانس گرانولار(Speckled) دارند ولی کروموزوم‌ها کاملاً واضح و بدون فلورسانس می‌باشند.در برش‌های بافتی کبد میمون هیچ‌گونه واکنش گرانولار (Speckled) در هسته هپاتوسیت‌ها مشاهده نمی‌شود ولی هستک‌ها در نمونه‌هایی که تیتر بالایی از آنتی‌بادی را دارند فلورسانس ملایمی از خودشان نشان می‌دهند.

آنتی‌ژن‌های هدف: SS-A & SS-B

کاربرد بالینی: آزمایش ANA مثبت با این الگوی فلورسانسی برای تشخیص سندرم شوگرن، SLE و لوپوس نئوناتال کاربرد دارند.

 

 

 

 

آزمایش ANA ؛ آنتی‌بادی ضد KU (AC-4)

در روش IIFT، با سلول‌های HEp-2 آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن KU یک فلورسانس گرانولار ملایم fine-speckled)) در هسته سلول و هستک‌ها ایجاد می کند. تشخیص افتراقی این الگوی فلورسانسی با الگوی SS-A، SS-B، Sm و RNP مشکل است. در الگوی KU کروموزوم های  سلول‌های فاز میتوتیک رنگ نمی گیرند.

در این مورد خاص سلول‌های کبد میمون یک الگوی فلورسانس گرانولار به هم چسبیده (Clump-Speckled) را در هسته سلول از خود نشان می‌دهد که تقریباً اثبات کننده حضور آنتی-KU است.

کاربرد بالینی: آزمایش مثبت ANA  و الگوی فلورسانس KU  24 تا 55 %در سندرم Overlap    پلی درماتومیوزیت و سیستمیک اسکلروز پیشرونده اغلب با پر فشاری اولیه ریوی (Primary pulmonary hypertension) ، 5 تا 10 %انواع اشکال میوزیت ، 10 % SLE  و حدود 5 % سیستمیک اسکلروز پیشرونده مشاهده می شود

 

 

آزمایش ANA ؛ اتوآنتی‌بادی ضد Mi2 (AC-4)

اتوآنتی‌بادی ضد Mi-2 یک فلورسانس گرانولار ملایم (fine-speckled) در هسته سلول‌های HEp-2 همراه با فلورسانس نسبی هستک‌ها از خود نشان می دهد. الگوی فلورسانس Mi-2 در سلول‌های کبد میمون یک الگوی فلورسانس  گرانولار ملایم fine-speckled) ) در هسته هپاتوسیت‌ها ایجاد می کند.

کاربرد بالینی:آنتی‌بادی ضد Mi-2 مارکر بسیار اختصاصی برای درماتومیوزیت همراه با nail fold hypertrophy  می‌باشد. این اتوآنتی‌بادی‌ها در 15 تا 30 % بیماران مبتلا به درماتومیوزیت و 12-8 درصد بیماران مبتلا به میوزیت ایدیوپاتیک مشاهده می‌شود.

 Overlap Syndrome: یک بیماری اتو ایمیون بافت همبند است که در آن فرد مبتلا علائم دو یا چند بیماری را نشان میدهد مانند Mixed Connective tissue disease و اسکلرومیوزیت

 

 

 

آزمایش ANA با اتوآنتی بادی علیه TIF1-gamma (AC-4)

اتوآنتی بادیهای علیه TIF1-gamma  الگوی فلورسنس گرانولار در سلولهای HEp-2 ایجاد می نمایند که در سر تالسر هسته سلول توزیع می شود ولی در هستک به این صورت نیست. سلولهای میتوتیک نیز الگوی گرانولار خوبی را بروز می دهند ولی کروموزومها اینگونه نیستند.

آنتی بادیهای علیه TIF1-gamma با استفاده از سلول های RTC   (Recombinatin Transfected Cells) قابل ردیابی است در این سلول ها  الگوی گرانولار صاف فلورسانس در سیتوپلاسم مشاهده می شود. هسته سلولها فلورسانس ملایم و خفیفی به خود می گیرند.

کاربرد بالینی: آزمایش ANA  مثبت و وجود اتو آنتی بادی های علیه TIF1-gamma    با شیوع حدود 5 در صد در بیماران درماتوزیت یافت می شود به ویژه این اتوآنتی بادی با درماتو میوزیت مرتبط با کانسر (پارانئوپلاستیک) ارتباط دارد

Cancer Associated Paraneoplastic dermatomyositis (CAM)

 

آزمایش ANA ؛ اتوآنتی‌بادی ضد نوکلئوپلاسم و گرانولار درشت؛ Nucleoplasm & CoarseSpeckled (AC-5)

در سلول‌های HEP-2 نمای گرانولار خشن ( Speckled Coarse)، و یا گاهی با الگوی فلورسانس medium یا fine-speckled دیده می شود. که در تمام نوکلئوپلاسم گسترش دارد؛ هستک‌ها هیچگونه فلورسانسی ندارند؛ در سلول‌های فاز میتوز کروموزوم کاملاً متراکم و بدون فلورسانس می‌باشد در حالی که نوکلئوپلاسم هسته  الگوی فلورسانس هموژنوس و یکنواخت دارد.در مقاطع کبد میمون Primate Liver  الگوی فلورسنس گرانولار فلورسانس دیده می‌شود، هستک‌ها تیره هستند و فلورسانسی ندارند.آنتی‌بادی‌هایی که با هسته سلول‌های کبد میمون Primate Liver واکنش دارند، توزیع فلورسانس بسیار شبیه به سلول‌های HEP-2 را از خود نشان می‌دهند.

آنتی‌ژن هدف:  . hnRNP , RNA polymerase 3 ,U1-nRNP and Sm

کاربرد بالینی: آزمایش ANA  مثبت با این نمای فلورسانس با بیماری MCTD و SLE ارتباط دارد.

 

 

آزمایش ANA ؛ آنتی‌بادی علیه ذرات هسته‌ای (Nuclear Dots) (AC-6)

در فاز اینترفاز فلورسانس سلول‌های HEp-2 در گرانول‌ها با پراکندگی گسترده  با سایزهای متفاوت (از 5 تا 20 عدد) در سلول قابل مشاهده است. چنانچه آنتی‌بادی علیه میتوکندری‌ها AMA (که معمولاً در مجاری های اولیه صفراوی دیده می‌شود) هم‌زمان وجود نداشته باشند، سیتوپلاسم تیره و بدون فلورسانس است. در سلول های فاز میتوتیک ذرات هسته‌ای (Neuclear Dots) به نوعی در نوکلئوپلاسم محو شده است. بیرون کروموزوم‌های متراکم که فلورسانس کمی دارند گرانول‌های ایزوله با فلورسانس برجسته‌ای قابل مشاهده است.آنتی‌بادی‌های ضد ذرات هسته ایی (N.D)  در سلول‌های Primate Liver به همان شکل سلول‌های HEp-2 واکنش فلورسانس از خود نشان می‌دهند.

اگر هم‌زمان از روش (Biochip Mosaeic ) استفاده شود، آنتی‌بادی‌های ضدND  در سیروز اولیه صفراوی قابل مشاهده است.

آنتی ژن‌های هدف: این آنتی‌بادی‌ها اغلب علیه آنتی ژن‌های SP.100، SP.140، PML و SUMO واکنش نشان می‌دهد.

کاربرد بالینی: آزمایش ANA  مثبت و اتوآنتی‌بادی‌های (N.D) در 25 تا 40 درصد مبتلایان به کلانژیت اولیه صفراوی قابل ردیابی است. این الگوی فلورسانسی گاهی در بیماری های روماتوئید هم مشاهده می شود.

 

 

آزمایش ANA ؛ آنتی بادی علیه ذرات هسته ای محدود few Nuclear Dots (AC-7 )

 الگوی فلورسانس سلول های HEp-2 ، تعداد ذرات هسته ای محدود ( 1 تا 6 عدد ذره هسته ای در هر سلول) به ویژه نزدیک هستک ها مشاهده میشوند.

در فاز S/G2 تقسیم سلولی ، تعداد بیشتری ( بین 4 تا 6 عدد ) ذره هسته ای با فلورسانس واضح در هسته سلول قابل مشاهده است .

کروماتین سلول در مرحله متافاز اغلب فلورسانس ندارد. این ذرات هسته را اکنون اجسام کاجال Cajal Bodies ( که بیشتر اجسام کلوئید خوانده میشوند ) می نامند. در سلول های P-L نسبت به سلول های HEp-2 ذرات هسته ای قدری فلورسانس آشکار تر و واضح تری دارند.

بقیه اجزاء بافت کبد فلورسانس ندارد.

آنتی ژن های هدف: P-80 کوئیلین ،    SMN: survival of motor neuron

کاربرد بالینی:  آزمایش ANA  مثبت با این الگوی فلورسانسی در سندرم شوگرن و SLE مشاهده میشود.

 

 

آزمایش ANA ؛ اتوآنتی‌بادی ضد PM-Scl (AC-8)

وجود اتوآنتی‌بادی‌های ضد PM-Scl  الگوی ایمونوفلورسانس هموژنوس در هستک‌ها همراه با فلورسانس ضعیفتر با الگوی گرانولار ملایم fine-speckled) )  در نوکلئوپلاسم سلول های HEp-2 ایجاد خواهد کرد. در سلول‌های میتوتیک، کروموزوم‌ها رنگ نمی‌گیرند و نمایی از فلورسانس گرانولار ملایم fine-speckled) )  در بیرون کروموزوم‌های متراکم مشاهده می‌شود.در سلول‌های کبد میمون یک فلورسانس هموژنوس در هستک سلول‌ها و فلورسانس ضعیف‌تر و یک دست در تمام سلول ها قابل مشاهده  است.

کاربرد بالینی: آنتی‌بادی ضد PM-Scl و در 24تا 55  % بیماران مبتلا به پلی‌میوزیت و اسکلروز سیستمیک  گاهی با بروزهمزمان سندروم Overlap  مشاهده می‌شود. اتوآنتی‌بادی‌های ضد آنتی ژن ها PM-Scl-75، PM-Scl-100 اغلب همزمان در این بیماری‌ها قابل ردیابی است. اگر بیماری اسکلروز سیستمیک پیشرونده به طور خاص مطرح باشد آنتی‌بادی ضد PM-Scl-75 با شیوع 10 % و ضد PM-Scl-100 با شیوع 7 % دیده می‌شود.

چنانچه از روش های آزمایشگاهی استفاده شود که فقط آنتی بادی ضد  PM-Scl-100را ردیابی می کند ، ممکن است بیماری اسکلروز سیستمیک پیشرونده تشخیص داده نشود.

 

.

آزمایش ANA ؛ آنتی‌بادی ضد U3-nRNP/fibrillarin (AC-9)

سلول‌های HEp-2 در فاز اینترفاز فلورسانس گرانولار Speckled در هستک‌ها دارند و سلول‌های میتوتیک  فلورسانس اطراف کروموزم از خود نشان می دهد.

سلول‌های کبد میمون، فلورسانس هموژنوس را در هسته سلول‌ها ظاهر می کنند.

کاربرد بالینی: آنتی‌بادی علیه فیبریلارین فقط در سیستمیک اسکلروزیز پیشرونده (Diffuse form) با شیوع 5 تا 10% یافت می‌شود.

 

 

 

 

 

آزمایش ANA ؛ اتوآنتی‌بادی علیه SCL-70  

در سلول‌های HEp-2 تقریباً همیشه هسته ها فلورسانس هموژنوس در سلول‌های فاز اینترفاز از خود نشان می دهند. هستک‌ها  فلورسانس کاملاً واضح و برجسته دارند. در سلول‌های میتوتیک تنها حاشیه کروموزوم‌های متراکم فلورسانس مشخصی دارند.هسته سلول های کبد فلورسانس هموژنوس غالبی را از خود نشان می دهند . هسته سلول های اپیتلیال  توبولار در برش بافتی کلیه فلورسانس واضحی دارد.

کاربرد بالینی: آنتی‌بادی‌های SCL-70 در 25 تا 75% بیماران مبتلا به  اسکلروز سیستمیک  پیشرفته (شکل Diffuse) بسته به فعالیت بیماری‌ها و روش آزمایش دیده می شود.

 

 

 

 

آزمایش ANA ؛ اتوآنتی‌بادی ضد RNA پلیمراز-I (AC-10)

با حضور این اتوآنتی‌بادی در سلول‌های HEp-2 فلورسانس گرانولار در هستک سلول‌ها مشاهده می‌شود. نوکلئوپلاسم سلول‌ها اغلب بدون فلورسانس است. در سلول‌های میتوتیک ناحیه کروموزوم‌های متراکم شده، رنگ نمی گیرد. بیرون کروموزوم‌ها یک نمای فلورسانس ملایم گرانولار تا یکدست دیده می‌شود و تعداد زیادی ذرات برجسته فلورسانس با عنوان  Nucleolus Organizer regions (NOR) مشاهده می شود. هسته  سلول ها، فلورسانس هموژنوس و یک دستی را نشان می دهد. 

کاربرد بالینی:  آنتی‌بادی ضد RNA پلی‌مراز-I بیشتر در بیماری  اسکلروز سیستمیک پیشرونده (Diffuse Form) با شیوع حدود 4% مشاهده می‌شود.

 

 

 

 

آزمایش های ANA ؛ اتوآنتی بادی ضد NOR-90  AC10))

سلول های HEp-2 در متافاز یک یا چند نقطه فلورسانس را در کروموزوم متراکم خود  نشان میدهند که منطبق با Nucleolus Organizer regions (NOR) هستند. زیرمحموعه  الگوی فلورسانسی RNA  پلی مراز است. سیتوپلاسم سلول های در حال تقسیم ، فلورسانس ضعیف از خود نشان میدهند. هسته سلول ها در فاز اینترفاز نمای فلورسانس گرانولار دارند.

ارتباط بالینی : اسکلروز سیستمیک پیشرونده Diffuse form))

 

 

 

آزمایش ANA ؛ اتوآنتی‌بادی‌های ضد غشاء هسته ای؛ Nuclear Membrane  (AC-11/ AC-12)

این اتوآنتی‌بادی‌ها در سلول‌های اینترفازی HEp-2 به صورت یک الگوی فلورسانس Homogeneous  حلقه‌ای اطراف هسته سلول تظاهر می کند. کروموزوم‌ سلول‌های در حال تقسیم (میتوتیک) تیره و بدون فلورسانس می‌باشند.در مقاطع بافتی  کبد میمون یک حلقه فلورسانس برجسته در غشاء هسته سلول ها مشاهده می‌شود.

آنتی‌ژن هدف: آنتی‌ژن‌های سلولی که با این اتوآنتی‌بادی واکنش نشان می‌دهند عبارتند از:gp210, LaminA, LaminB, LaminC, LaminB Receptor

کاربرد بالینی:آنتی‌بادی ضد غشاء هسته‌ای در بیماری سیروز اولیه صفراویPrimary Biliary cholangitis  (PBC) مشاهده می‌شود.

 

 

 

 

آزمایش ANA ؛ آنتی بادی علیه PCNA (AC-13)

 اتو آنتی بادی های ضد  PCNA  الگوی فلورسانسی وابسته به سیکل سلولی با سلول های HEp-2 از خود نشان می دهد. نیمی از هسته سلول ها در اینترفاز فلورسانس روشن و برجسته و نمای گرانولار ملایم fine-speckled) ) دارند ، هستک ها هیچگونه فلورسانسی ندارد.

نیم دیگر هسته ها الگوی فلورسانس مشابه ولی در حدود 10 برابر کمتر دارند.. ناحیه متراکم کروموزومها در میتوز رنگ نشده است، نواحی اطراف کروموزومها فلورسانس گرانولار ملایم fine-speckled) ) دارد که از نظر الگو و شدت منطبق با قسمت های تیره تر هسته سلولهای اینترفاز است.

هسته بیشترسلولهای کبد میمون فلورسانس ندارند.

کاربرد بالینی: آنتی بادیهای PCNA برای بیماری SLE اختصاصی است. اگرچه شیوع آن فقط 3% است.

 

 

 

 

 


نویسندگان

دکتر محمدرضا عزیزی (دکتری علوم آزمایشگاهی بالینی)، دکتر الهام عبدالهی، فیروزه ربیعی، نیلوفر نقشینه، دکتر ریحانه رهنما، واحد تحقیق و توسعه آزمایشگاه پاتوبیولوژی و ژنتیک اریترون

دسته بندی مطالب

غربالگری سلامت جنین غربالگری سلامت نوزادان غربالگری و پیشگیری از سرطان خدمات تشخیص پزشکی و بالینی خدمات ایمونولوژی و ایمونوفلورسانس خدمات پاتولوژی و سیتو پاتولوژی آموزش های همگانی و تخصصی همکاران و متخصصین آزمایشگاهی

تماس با ما


اریترون یک آزمایشگاه تخصصی است که از راه های مختلف می‌توانید با آن در تماس باشید و پرسش ها و مشکلات خود را به آسانی با متخصصین ما در میان بگذارید.

 

ساعت کار آزمایشگاه از 06:30 صبح الی 10 شب به طور یکسره و روزهای تعطیل از 7 صبح الی 2 بعد از ظهر

اصفهان / خیابان شیخ صدوق شمالی / خیابان شیخ مفید غربی

جواب آزمایش خود را به آسانی از طریق ربات تلگرامی به آدرس [email protected] دریافت نمایید.

شماره تماس : 2-36633621 - 031

شماره فکس: 89784728- 021

[email protected]

کد پستی : 76351-81647