مقدمه

در تکنیک های وسترن بلات، PCR،Real time ، نیازمند دسترسی به کل محتوای ژنتیکی سلول و یا محتوای پروتئینی هستیم. بنابراین باید غشای سلول تخریب شود و در نتیجه ما خود سلول را دیگر نخواهیم داشت. اما برخی از تکنیک های شناسایی پروتئین وجود دارند که بدون از بین رفتن غشای سلول می توانند در تشخیص سلول محقق را یاری کنند. از جمله این تکنیک ها  می توان به فلوسایتومتری و ایمونوفلورسنت اشاره نمود(.1) تکنیک فلوسایتومتری، تکنیکی است که سلول ها را به طور سوسپانسیون (نه چسبنده) مورد آنالیز قرار می دهد. در حقیقت شرط اصلی در کار با این تکنیک این است که سلول ها حتماً به صورت سوسپانسیون باشند. بنابراین نمونه هایی که به صورت بافت هستند اگر نیاز به بررسی با فلوسایتومتری دارند باید حتماً به صورت سوسپانسیون در آورده شوند(2).کاربردهای مختلفی برای فلوسایتومتری وجود دارد که از جمله مهمترین آنها می توان به ایمیونوفنوتایپینگ لوسمی های حاد و مزمن، بیماری های پلاسما سل ها، پایش درمان در لوسمی ها، تعیین فاکتورهای مؤثر در پیش آگهی، تشخیص بیماری های نقص ایمنی ارثی و اکتسابی اشاره کرد. فلوسایتومتری نقش مهمی در زمینه های مختلف آسیب شناسی، هماتولوژی، ایمنی شناسی، بیمار ی های عفونی، بررسی پیوند اعضاء، نئوپلازیا و ژنتیک دارد و از طرفی بررسی وقایع چرخه سلولی و نقایص موجود در DNA جهت تشخیص انواع لوسمی ها و لنفوم ها بوسیله فلوسیتومتری امکا ن پذیر است . همچنین این روش در تشخیص بیماری ها، تعیین پیش آگهی و هم برای ارزیابی درمان بدخیمی ها کاربرد دارد . فلوسایتومترهای کلینیکی معمولاً برای استفاده  آزمایشگاه های کلینیکی تنظیم شده است، اما بعضی از آنها ظرفیت جداسازی انتخابی سلول ها را  Sorting  دارا می باشند که در کارهای تحقیقاتی مورد استفاده هستند(3).

 

فلوسیتومتری و اپوپتوز سلول ها

آپوپتوز یکی از شکل‌های مرگ سلول می‌باشد که از نظر بیولوژی اهمیت زیادی دارد و به همین دلیل ردیابی و اندازه‌ گیری آپوپتوز در تحقیقات و موارد بالینی اهمیت پیدا می‌کند. سلول‌های در حال آپوپتوز نشانه‌های زیادی دارند که قابل اندازه ‌گیری با فلوسایتومتری می‌باشند این نشانه‌ها عبارتند از تغییرات در غشاء پلاسمائی سلول، تغییرات در نفوذپذیری غشاء پلاسمائی، تغییرات در نفوذپذیری غشاء میتوکندری، فعال‌سازی کاسپازها و شکستگی‌های DNA سلولی. شناسایی هر یک از این تغییرات به تنهایی یا ترکیبی از آنها به وسیله فلوسایتومتری، امکان شناسایی و اندازه ‌گیری سلول‌های آپوپتوتیک را از میان مخلوطی از سلول‌های دیگر فراهم می‌کند همچنین اطلاعات با ارزشی درباره مسیر مولکولی مرگ سلول‌ها به دست می‌آید(4).

 

فلوسیتومتری و انالیز DNA

دسترسی به رنگ‌های فلورسنتی که به صورت خطی و متناسب با غلظت به DNA سلولی متصل می‌شوند فلوسایتومتری را برای آنالیزDNA توانمند ساخته است. امروزه تعیین کمی مقدار DNA، شناسایی سلول‌های دیپلوئید نرمال در حالت استراحت، شناسایی سلول‌هایی که به طور فعال DNA سنتز می‌کنند و شناسایی سلول‌هایی که در مرحله پیش میتوز و یا میتوز هستند توسط فلوسایتومتر امکان پذیر شده است. هنگامی که فازهای مختلف چرخه زندگی سلول‌ها مشخص شدند، می‌توان با توام‌کردن روش‌های ردیابی پروتئین‌های مؤثر در چرخه سلولی به وسیله آنتی‌بادی‌های اختصاصی و روش تعیین مقدار DNA بیان پروتئین‌ها را در فازهای مختلف زندگی سلول‌ها بررسی کرد. اضافه‌نمودن آنالوگ تیمیدین یا بروموداکسی یوریدین به محیط کشت سلولی امکان شناسایی سلول‌هایی را فراهم می‌کند که فعالانه در حال سنتز DNA هستند. با استفاده از روش تعیین مقدار DNA همچنین می‌توان تعداد کروموزوم‌ها (هنجار یا ناهنجار) را مشخص کرد. سلول‌هایی که به حالت پلوئیدی (برای مثال در مگاکاریوسیت‌ها) و یا آناپلوئیدی (برای مثال در بیماری‌های بدخیم) می‌باشند نیز با این روش قابل شناسایی هستند(5).

 

مزایای سیستم فلوسایتومتری بر سایر روش های اندازه گیری فلورورسانس

1. Objective عینی بودن 

2. حساسیت بالا:دستگاه می تواند تا بیش از هزار مولکول فلوئوروکروم را در سلول مشخص کند

3. سرعت عمل زیاد که بررسی تعداد زیادی سلول را ممکن می سازد

4.  توانایی تشخیص سلول های نادر با مشخصات اختصاصی در یک جمعیت هتروژن و ناهمگن

5.  توانایی مطالعه سلول های زنده فیکس نشده

6. توانایی اندازه گیری معیارهای همزمان چندین پارامتر و تطابق چند حساسیت هر سلول معلق در مایع

دستگاه های فلوسایتومتر از 3 بخش اصلی تشکیل شده اند که شامل:

سیستم پدید آورنده ی جریان (Fluidics System)، سیستم نوری (Optical System) و سیستم الکترونیک و پردازش (Electronics Systems) می باشد(6).

 

 سیستم پدید آورنده جریان:

همان طور که در بالا به آن اشاره شد شرط اول در کار با این تکنیک سوسپانسیون بودن سلول های مورد بررسی می باشد. در کل سلول های موجودات مختلف یا به صورت فشرده در یک بافت قرار دارند(مانند اکثر بافت های بدن) و یا خود در محیطی سوسپانسیون قرار دارند(مانند خون( .سلول های مورد بررسی اگر سلول های خونی باشند نیازی به digestion هضم کردن آن ها وجود ندارد. اما اگر به صورت بافت باشند ابتدا باید توسط آنزیم های مختلف و یا به صورت مکانیکی و یا حتی به هر دو صورت، بافت را هضم نمود تا بتوان از بافت فشرده شده، سوپ سلولی تهیه نمود. آنزیم های مختلفی جهت هضم بافت ها وجود دارد که بسته به نوع بافت،سختی آن، مواد تشکیل دهنده آن باید نوع مناسب آن انتخاب شود. البته شایان ذکر است این انتخاب نباید به گونه ای باشد که به خود سلول صدمه زده و سبب مرگ آن شود(7).

 

تمرکز هیدرودینامیک  Hydrodinamic Focousing

خصوصیت اصلی یک سیستم فلوسایتومتری این است که اندازه گیری ها بر روی نمونه های سلولی که در دستگاه جریان می یابند، انجام می شود. اگر از یک لوله جهت انتقال نمونه استفاده شود، سلول ها نمی توانند به طور مکرر به نقطه اندازه گیری  محل برخورد لیزر به سلول  بروند. اگر از لوله های باریک جهت اطمینان از انتقال تکرار پذیرسلول ها استفاده شود، احتمال دارد با عبور سلول های بزرگتر مسیر بسته شود. برای حل این مشکل از روش تمرکز هیدرودینامیک Hydrodinamic Focousing کمک گرفته می شود. در این روش جریان آرامی از سلول ها را به درون جریان حامل سریع( Sheath fluid) وارد می کنند. مایع حامل، سلول ها را در مرکز لوله متمرکز می کند، بنابراین سلول ها به طور منظم و در یک مسیر مجازی به نقطه اندازه گیری منتقل می شوند.(8, 9)

شکل1-تمرکز هیدرودینامیک در دستگاه فلوسایتومتری نشان داده شده است.

هدف از آماده سازی نمونه، تهیه یک سوسپا نسیون از پارتیکل های منفرد است که به روش خاصی رنگ آمیزی شده اند تا در سیستم، بدون ایجاد اختلال در جریان یکنواخت مایع سیال و یا انسداد لوله و منافذ دستگاه عبور کنند .درسیستم فلوسایتومتری، سلول های معلق در مایع ایزوتونیک از طریق سیستم حسی با فشار هوا از ظرف حاوی نمونه به لوله مخصوصی منتقل شده و به یک محفظه خاصی به نام حفره جریان Flow chamberوارد می شوند.مایع پوششی Sheath fluid در حفره نمونه، یک اثر تمرکز هیدرو دینامیکی ایجاد کرده و نمونه را به داخل جریان  می کشاند که زیادتر بودن سرعت جریان مایع پوششی نسبت به مایع حاوی نمونه، سبب هدایت سلو ل ها به صورت منفردو تک تک جهت عبور از سوراخ انتهایی  می شود تا در نقطه خاصی در مقابل اشعه لیزر قرار بگیر د . سلول از لوله شیشه ای با سرعتی حدود 5 تا 50 متر در ثانیه از میان منفذی باریک و از مقابل پرتو ی یک یا چند منبع نو ری که غالبا لیزر است، عبور می کنند. بدین ترتیب امکان جمع آوری اطلاعات مربوط به 5000 تا 50000 سلول در هر ثانیه فراهم می شود(10).

شکل2-نحوه حرکت سلول ها به صورت تک تک و منفرد از مقابل نور لیزر نشان داده شده است.

بنابراین دو شرط اصلی برای نمونه های که قرار است با تکنیک فلوسایتمتری بررسی شوند وجود دارند:

1. سوسپانسیون بودن

2. عبور تک تک از مقابل منبع نوری(11).

سیستم نوری:

دومین بخش از دستگاه فلوسایتومتری، سیستم نوری است. این سیستم دارای دو بخش کلی دارد. یکی منبع تولید نور و دیگری آینه ها و فیلترهای هدایت کننده نور.

انواع مختلفی از منابع نوری برای فلوسایتومتر وجود دارند. در فلوسایتومترهای مدرن، نور لیزر به عنوان منبع نوری

بکار میرود، لیزر نسبت به جیوه یا لامپ های دیگر مزایایی دارد که از آن جمله میتوان به تولید نور منوکروم تک رنگ و با اندازه نقطه ای بسیار کوچک آن اشاره کرد، این اندازه نقطه ای بسیار مهم است، زیرا هرچه نور در فضای کوچک تری محدود شود، میزان تهییج سلول به حد ماکزیمم نزدیکتر می شود، علاوه بر این باعث اطمینان از قرار گرفتن تنها یک سلول در برابر نور در هر لحظه میگردد. بیشترین لیزر مصرفی نیز، لیزر آرگون با طول موج 488 نانومتر می باشد که با هوا سرد میشود. لیزرهای دیودی نیز به دلیل پایداری مورد استفاده قرار می گیرند و معمولا طول موج 635 نانومتر آن مورد استفاده است.(12)

جزء دوم این بخش آینه هایی است که در دستگاه ها تعبیه شده اند. این آینه ها یا فیلتر ها نوع خاصی از آینه ها هستند که طول موج خاصی را از خود عبور داده و طول موج خاصی را منعکس می کنند. به این گونه فیلتر ها یا آینه ها، Dichroic mirror گفته می شود(13).بسته به اینکه این آینه ها چه طول موج خاص را عبور و یا منعکس می کنند به سه دسته تقسیم بندی می شوند:

1- فیلترهای   Long Pass: این گونه فیلترهاطیف نوری با طول موج های برابر یا بیشتر از مقدار مشخصی را از خود عبور می دهند و مابقی را منعکس می کند. به عنوان مثال فیلتر BP 500 طیف های نوری با طول موج های برابر یا بیشتر از 500 نانومتر را از خود عبور می دهد و طول موج های کمتر از آن را منعکس می کند.

2- فیلترهای   Short Pass: در این فیلترها طیف های نوری با طول موج های برابر یا کمتر از مقدار تعیین شده عبور می کنند و غیر از آن منعکس می شوند. برای مثال فیلتر SP 500 طیف های نوری با طول موج های برابر یا کمتر از 500 نانومتر را از خود عبور می دهد و طول موج های بیشتر را منعکس می کند.

3-فیلترهای   Band Pass : فیلترهایی هستند که محدوده مشخصی از طیف نوری را از خود عبور می دهند. برای مثال فیلتر BP 500/50 طیف نوری بین 475 تا 525 نانومتر را عبور می دهد و غیر از آن را منعکس می کند.(14)

 

شکل 3- فیلترهای نوری فقط طول موج خاصی را عبور دداده و مانع عبور طول موج های دیگر می شوند.در این شکل نحوه عملکرد فیلترهای Long Pass,Short Pass,Band Pass نشان داده شده است

 

 سیستم الکترونیک و پردازش

در این قسمت، سیگنال ها و ولتاژهای ایجاد شده ی حاصل از برخورد نور لیزر به سلول به داده های دیجیتالی تبدیل می شوند تا به وسیله ی نرم افزاردستگاه قابل تجزیه و تحلیل باشند. سیگنال ها در سیستم های قدیمی به شکل آنالوگ ثبت می شدند در حالی که امروزه یک مبدل آنالوگ به دیجیتال (Analogue to Digital Converter(ADC آن ها را به داده های دیجیتالی تبدیل می کند به این شکل که با توجه به کیفیت ثبت سیگنال در آشکارساز برای هر مقدار ولتاژ حجمی از داده کامپیوتری به صورت بایت (Byte) درنظر می گیرد به این معنی که ولت به بایت تبدیل می شود.این امر قابلیت بیشتر آنالیز سیگنال ها، تقویت و یا تضعیف آن ها را میسر می سازد. زمانی که یک سلول از مقابل منبع نوری عبور می کند بر روی تمام آشکار سازها سیگنال ایجاد می کند که همان پالس الکتریکی( ولتاژ ) است. بر اساس این که چه میزان از ذره در مقابل منبع نوری قرار گیرد، پالس ایجاد شده می تواند ضعیف یا قوی باشد. چنانچه نمودار ولتاژ بر حسب زمان برای هر سلول رسم شود به صورت یک پالس خواهد بود که واجد یک پیک می باشد. هر پالس دارای ویژگی های ارتفاع (Height; H) ، پهنا (Width; W) و سطح زیر نمودار ( Area; A) است(15).

   

         شکل4- نمودار ولتاژ بر حسب زمان برای هر سلول به صورت یک پالس خواهد بود که واجد یک پیک می باشد. هر پالس دارای ویژگی های ارتفاع (Height; H) ، پهنا (Width; W) و سطح زیر نمودار ( Area; A) است.

 

سرنوشت نور پس ازبرخورد به سلول ها

سلولها پس از مکش توسط دستگاه در منطقه ای البته پس از تک تک شدن با لیزر روبه رو می شوند. نتیجه برخورد نور لیزر به یک سلول،‌ پراکندگی نور در جهات مختلف است که گاهی با تغییر در طول موج نیز همراه است. در حقیقت زمانی که نور لیزر به ذره ای برخورد می کند، برخی از پرتوهای لیزر با همان طول موج از جوانب سلول گذشته و در زوایای 2 تا 10 درجه در مقابل سلول پراکنده می شوند که آن را پراکندگی جلویی (Forward Scatter, FSC) گفته می شود و در حقیقت بیانگر اندازه (Size) سلول است که می توان به وسیله ی آن اندازه ی سلول را مورد بررسی قرار داد. برخی از پرتوهای لیزر نیز به درون سلول وارد شده و به ساختارهای درونی سلول مثل گرانول ها، واکوئل ها، هسته و ساختارهای درون سلولی برخورد کرده و در زوایای 10 تا 90 درجه پراکنده می شوند. این پراکندگی ها که نشان دهنده ی پیچیدگی های درون سلول هستند، پراکندگی جانبی (Side Scatter,SSC) نام دارد و در حقیقت نشان دهنده میزان گرانولوسیتی سلول است. طول موج پراکندگی جانبی نیز برابر با طول موج تابیده به سلول است. به طور کلی هر ذره ای که از مقابل نور لیزر عبور می کند، دارای یک اندازه و گرانولیتی مشخص است که در نمودارهای فلوسایتومتری قابل ردیابی و نمایش می باشد. به طور مثال اگر سلولهای خون محیطی انسان را در دستگاه فلوسایتومتری بررسی کنیم شاهد جمعیت های مختلف سلولی از جمله مونوسیت ها، گرانولوسیت ها و لنفوسیت ها خواهیم بود که بسته به اندازه و گرانولیتی اشان در نودار فلوسایتومتری قابل تمیز از هم هستند(1).

شکل5-جمعیت های مختلف سلولی از جمله مونوسیت ها، گرانولوسیت ها و لنفوسیت که بسته به اندازه و گرانولیتی اشان در نودار فلوسایتومتری قابل تمیز از هم هستند.

اما قابل ذکر است در اکثر موارد نمی توان سلول ها را بر حسب اندازه و گرانولیتی آنها با هم قیاس نمود زیرا بسیاری از آنها شبیه هم هستند و اندازه و گرانولیتی مشابه دارند، به راحتی نمی توان از روی سایز و اندازه و گرانولیتی یک سلول پی به ماهیت آن برد. یکی از مهمترین کلیدها در رفع این مشکل استفاده از آنتی بادی و آنتی ژن و واکنش بین این دو با هم است. به طوری که اگر ما بتوانیم برای شناسایی سلول مورد نظر خود آنتی بادی اختصاصی برعلیه آنتی ژن شناسایی کنیم و آن آنتی بادی را به رنگی یا فلوروکرومی متصل کنیم خواهیم توانست سلول مورد هدف را شناسایی کنیم.اما این دستگاه به چه شکل می تواند رنگ مورد استفاده را شناسایی کند؟ همان طور که می دانید هر مولکول در اطراف خود دارای الکترون های است که در اطراف هسته در حال گردش اند. حال اگر این الکترون ها توسط منبع نوری مانند لیزر برانگیخته شوند، از لایه اصلی خود خارج شده و به مدار بالاتر می روند. اما این الکترون ها تمایل به ماندن در لایه های بالاتر را نداشته و تمایل دارند به لایه خود حرکت کنند. این برگشت از یک لایه بالاتر به لایه پایین تر با از دست دادن انرژی همراه است. حال اگر این مولکول یک فلورکروم باشد بنابراین انرژی از دست رفته را به شکل نور نمایش خواهد داد.(16)

 به هنگام آماده سازی سلول ها و اتصال رنگ های گوناگون فلورسنس به سلول،‌ پرتوهای تابیده شده پس از برخورد تغییر طول موج داده و در زوایای 10 تا 90 درجه پراکنده می شوند که آن را به عنوان پراکندگی های فلورسنس (Fluorescence Scatter) می شناسند. طول موج بازتابی در این نوع پراکنش با توجه به رنگ فلورسنس به کار رفته متغیر است. سپس طیف های نوری ایجاد شده توسط فیلترها و آیینه ها به سمت آشکار سازها (Detector ) هدایت شده و سیگنال های ایجاد شده را ثبت می کنند. این فیلتر ها یا آشکارسازها که طول موج های مختلف فلورسنس را دریافت می کنند با توجه به تعدادشان شماره گذاری می شوند که معمولاً در بیشتر دستگاه های فلوسیتومتری پرتوهایی با طول موج 520 تا 570 (محدوده سبز( FL1 =، پرتوهایی با طول موج 585-620 )محدوده نارنجی( FL2= و پرتوهایی با طول موج 625-760 )محدوده قرمز( FL3= را شامل می شوند.(17)

در داخل آشکارسازها پرتوها توسط گروهی از تقویت کننده ها، تقویت شده تا بتوانند به یک ولتاژ ساده الکتریکی مبدل شوند و سپس در قسمت الکترونیک به داده های دیجیتالی تبدیل شده و در انتها، توسط نرم افزارهای مخصوص قابل تجزیه و تحلیل می شوند. البته شایان ذکر است که برخی از پرتوها نیاز به تقویت کننده های قوی ندارند اما برخی نیاز به تقویت شدن مفصل دارند(17).

 

 آنالیز اطلاعات Gating

اطلاعات جمع اوری شده توسط فلوسیتومتر را میتوان در بُعد واحدی و یا در دو بعد و یا حتی سه بعد برای تولید یک هیستوگرام رسم نمود . مناطقی از این هیستوگرام را میتوان به صورت مرتب بر اساس شدت فلورسنت از هم جدا کرد . این کار با استفاده از "واحد های استخراجی" انجام میگیرد که به آنها "گیت" می گویند . پروتکل های اختصاصی Gatting برای شناسایی بیماری ها و همچنین اهداف کلینیک و آزمایشگاهی به خصوص در خون شناسی تعریف و ایجاد شده است . رسم ها معمولا در مقیاس های لگارتیمی ساخته می شوند. از انجا که طیف رنگ های فلورسنت با هم ، همپوشانی دارند سیگنال ها در دتکتورها (آشکارسازها) باید از نظر الکتریکی و محاسباتی جدا شوند (18). داده های گردآوری شده با فلوسیتومتری توسط نرم افزار های مختلفی مانند WinMD ، Flowjo ، Cell quest Pro بررسی می شوند . بعد از اینکه داده ها جمع آوری شدند دیگر نیاز به اتصال دستگاه فلوسیتومتری نیست . به همین دلیل است که بررسی ها معمولا در رایانه جداگانه ای انجام میگیرد(1, 19).

 

جداسازی سلولی sorting

یشترین مورد استفاده از فلوسایتومتری ارزیابی آنتی‌ژن‌های سطحی بیان‌شده بر روی سلول‌ها می‌باشد. اما علاوه بر آن سلول‌ها ممکن است با روش‌های مختلف برای اندازه‌گیری خصوصیات عملکردی بوسیله فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گیرند. می‌توان تغییرات زمانی بیان گیرنده‌ها را تعیین کرد یا برهمکنش یک نوع سلول را با سلول دیگر اندازه‌گیری نمود. بعلاوه، امکان ارزیابی تغییرات در فعالیت آنزیم‌ها و پتانسیل غشایی وجود دارد. همچنین می‌توان آزمایشاتی برای نشان دادن فاگوسیتوز و آزادسازی مولکول‌های فعال زیستی (bioactive) انجام داد(20).

کارآیی اصلی این جداسازها، جدا کردن جمعیت‌های سلولی دلخواه از میان جمعیتی هتروژن از سلول‌ها برای مطالعه بیشتر می‌باشد. بطور کلی اگر سلول یا ذره‌ای دارای خصوصیات منحصر به فردی از نظر فیزیکی یا شیمیایی باشد با استفاده از آن خصوصیات می‌توان براحتی آن را شناسایی کرده و توسط flow sorter از دیگر سلول‌های همراه جدا کرد(21).

شکل6-جدا کردن جمعیت‌های سلولی دلخواه از میان جمعیتی هتروژن از سلول‌ها توسط دستگاه فلوسایتومتری نشان داده شده است.

نتیجه گیری

روش فلوسیتومتری در سایه افزایش تعداد انتی بادی ها،تترامرها و رنگ های تولید شده برای استفاده درارزیابی فعالیت سلولها به عنوان یک ابزار مهم در مطالعه سلولهای سیستم ایمنی در امده است.و این امکان را فراهم اورده که انواع سلول های موجود در نمونه خون یا سلولهای کشت شده به تفیکیک مورد ارزیابی قرار بگیرند.