انواع روش های میکرواری

میکرواری براساس نوع مولکولی که شناسایی می شود.نامگذاری می گردد.انواع میکرواری ها عبارتند از: RNA ،DNA array میکرواری، پروتئین میکرواری و میکرواری بافتی.
یکی از پرکاربردترین انواع میکرواری، DNA array نامیده می شود که این روش از اطلاعات توالی ژنوم و ترانس کریپتوم برای آنالیز ساختار و عملکرد ژنها استفاده می کند. میکرواری، تکامل یافته روش بلاتینگ است. در روش بلاتینگ قطعاتی از مولکول (DNA) به یک غشا نیتروسلولزی متصل گشته و سپس توسط یک ژن مشخص، شناسایی می گردد. در میکرواری با استفاده از یک توالی تک رشته به نام پروب که بر روی یک سطح جامد (شیشه) قرار گرفته اند، ژن را شناسایی می کنند. اختصاصی ترین کاربرد میکرواری در اندازهگیری بیان ژنها است که امکان بررسی تعداد زیادی از ژنها را به طور همزمان امکان پذیر کرده است.  پروب یک توالی اولیگونوکلئوتیدی تک رشته با اندازه 30 - 18 نوکلئوتید است که می تواند بخشی از DNA ، محصول PCR و mRNA باشد. در DNA array هر نقطه روی اسلاید نشان دهنده یک ژن می باشد. میکرواری به دو مرحله اصلی تقسیم می شود: 
1- آزمایشگاه مرطوب که شامل مراحل آزمایشگاهی می باشد.
2- آزمایشگاه خشک که مربوط به آنالیز داده های میکرواری می باشد. این دو مرحله برای همدیگر لازم و ضروری هستند (شکل 1).

شکل 1: مراحل مختلف میکرواری به صورت شماتیک

آزمایشگاه مرطوب شامل مراحل زیر می باشد:
1- آماده سازی نمونه و استخراج ژنوم و یا RNA
2-  تهیه چیپ میکرواری با استفاده از پروب سنتز شده
3- نشاندار کردن به طور مستقیم یا غیرمستقیم cDNA با رنگ فلورسانس
4- هیبریداسیون شامل اتصال پروب با مولکول هدف
5-  شستشو و اسکن نمونه

آماده سازی مولکول هدف و نشان دار کردن آن
با توجه به هدف آزمایش، نوع مولکول استخراج شده و نحوه آماده سازی آن متفاوت است. در واقع مولکول هدف همان نمونه مجهول در آزمایش می باشد. چنانچه قرار باشد شناسایی بر روی سطح ژنوم قرار گیرد مولکول هدف DNA و اگر میزان بیان ژن موردنظر باشد، مولکول هدف mRNA می باشد. استخراج DNA با روش هایی از قبیل جوشاندن، الکالین فسفاتاز و کیت های موجود در بازار امکا نپذیر است و برای استخراج RNA از پروتکل مربوط به آن استفاده می شود. هردوی این مواد بر روی هیبریداسیون (دورگه سازی) اثر می گذارند، پس لازم است قبل از انجام آزمایش از لحاظ کمی کیفیت آنها بررسی شود. این کار با دستگاه اسپکتروفتومتری(نانو دراپ) انجام می شود. جذب 280 / 260 مربوط به DNA است که بین 8/ 1- 5/ 1 و جذب 260 / 230 مربوط به RNA می باشد که باید بین 1/8-2 باشد. برای بررسی کیفی می توان از الکتروفورز استفاده کرد. بعد از اینکه از خلوص و غلظت نمونه استخراج شده اطمینان حاصل شد، نوبت به نشان دار کردن آن با مواد فلورسانس است. در میکرواری دو نمونه با همدیگر روی یک اسلاید مقایسه می گردند) نمونه سالم و بیمار. پس باید هرکدام از نمونه ها با یک رنگ متفاوت نشان دار شود، به این مکانیسم میکرواری دو کاناله می گویند. رنگ رایجی که بیشتر مورد استفاده است Cy3 و Cy5 می باشد. رنگ Cy3 در طول موج 523 nm به رنگ سبز و رنگ Cy5 در طول موج 635 nm به رنگ قرمز دیده می شود.
نشاندار کردن به روش مستقیم بیشتر استفاده می شود که در حین سنتز رنگ به محیط اضافه شده و وارد زنجیره در حال سنتز می شود، تمایل رنگ Cy3 نسبت به Cy5 بیشتر است. در روش غیرمستقیم از dUTP که آنالوگ dTTP است و دارای یک گروه آمین است، استفاده می گردد. در رشته cDNA سنتز شده dUTP وارد می شود، پس به جای باز تیمین، یوراسیل قرار می گیرد. در مرحله بعد رشته با رنگ فلورسانس کوپل می گردد. بعد رنگ های کوپل نشده حذف و در نهایت یک رشته فلورسانس بدست می آید (شکل 2).
در نمونه هایی که به صورت mRNA می باشند باید برای انجام آزمایش به cDNA تبدیل شوند که این کار به دو علت است:
1-  پایداری cDNA از mRNA بیشتر است و کار کردن با آن راحت تر است.
2- نشان دار کردن cDNA راحت است و این کار را می توان با dNTP نشا ندار در حین سنتز انجام داد.

شکل 2: مراحل آماده سازی نمونه و تبدیل به cDNA و نشان دار کردن آن که به صورت
شماتیک نمایش داده شده است

ساخت و طراحی چیپ میکرواری
اسلاید یا چیپ یکی از اجزای اصلی آزمایش می باشد. برای ساخت اسلاید علاوه بر دستگاه اسپاتر برای قرار دادن توالی نوکلئوتیدی نیاز به بستر شیشه ای از جنس های مختلف مانند الومینوسیلیکات، زینک تیتانیوم، سیلیکا و بروسیلیکات برای اتصال پروب داریم. امروزه از سه فناوری برای ساخت چیپ ها استفاده می شود: 

• فتولیتوگرافی

• نقطه گذاری مکانیکی

• Ink jet

روش فتولیتوگرافی
فتولیتوگرافی در صنایع تراشه های رایانه ای به خوبی شناخته شده است. یکی از شرکت های اصلی در این زمینه Affymetrix می باشد. روش ساخت چیپ میکرواری با استفاده از این روش به این گونه است که پروب نوکلئوتید به نوکلئوتید سنتز می شود. تمام چیپ با یک ماده حساس به نور پوشانده م یشود که از اتصال نوکلئوتید به شیشه جلوگیری کند. در این روش، از یک منبع نور فرابنفش برای ساخت اولیگونوکلئوتیدها بر روی یک سطح شیشه ای سیلیکونی استفاده م یگردد. با استفاده از این فناوری م یتوان هزاران اولیگونوکلئوتید به طول 50 - 25 نوکلئوتید را بر سطحی با اندازه یک سانت یمتر مربع قرار داد.  

روش نقطه گذاری مکانیکی
بر پایه قرار دادن فیزیکی مواد بر روی سطوح با استفاده از سوزن های مخصوص استوار است. با توجه به اینکه مبنای کار این سیستم بر اساس تماس مستقیم سوزن با مقادیرکم مایع و انتقال آن بر اسایدهای شیشه ای است، امکان آلودگی به ذرات گردوخاک و تبخیر مایعات وجود دارد. برای ایجاد شبکه ای از DNA بر روی اسایدها، از بازوی روباتی استفاده م یشود که در سه محور Y ,X و Z حرکت می کند. مواد که حاوی DNA هستند. در ظرفی که 96 یا 384 چاهک دارد، قرار داده شده و سپس این بازو با توجه به الگویی که به آن داده م یشود، نقاط را بر روی اساید شیشه ای قرار م یدهد. شایان ذکر است که در نخستین مقاله ای که در زمینه ریزآرایه منتشر شد، عبارت هدف برای توصیف DNA روی اسلاید محصول PCR  و عبارت کاوشگر برای توصیف نمونه mRNA که با مواد فلورسانس نشان دار شده، به کار رفت. البته در کاربرد این لغات کمی اختلاف نظر بین محققان وجود دارد و برخی از آنها عکس این حالت را به کارمی برند. در این روش از یک بازوی روباتیک برای انتقال پروب استفاده م یشود. در این روش پروب قبلاً سنتز شده و توسط اسپاتر منتقل می گردد. این روش به دلیل ساده بودن بیشتر در آزمایشگاه های تحقیقاتی استفاده می شود. با استفاده از این روش می توان پروب هایی با طول 60 نوکلئوتید ایجاد کرد.

روش Ink jet
این روش مشابه روش قبل است، با این تفاوت که پروب مستقیم به سطح اسلاید متصل نمیشود. در این روش یک ترکیب شیمیایی به سطح متصل می شود و پروب به آن متصل میگردد.
در کل دو حالت برای اتصال وجود دارد:
1- پروب به صورت غیرکووالانسی یا با برقراری پل نمکی با پوشش شیمیایی سطح اساید پیوند برقرار کند.
2- پروب به صورت کووالانسی به پوشش شیمیایی سطح اساید متصل شود که این اتصال محک متر بوده و پیوند قوی تری ایجاد م یکند. برای این کار در انتهای 5 پروب توالی آمینی قرار م یدهند و برای اینکه ممانعت فضایی ایجاد نشود از یک ترکیب 6 کربنه برای ارتباط بین پروب و شیشه استفاده م یکنند. معمولاً برای پروب هایی با طول حدود 60 نوکلئوتید می توان از پوشش الدهیدی یا اپوکسی استفاده کرد و برای پرو بهایی که محصول PCR و یا ژنوم که طویل هستند از پوشش آمینی استفاده می شود.

منبع : مجله اخبار آزمایشگاهی جلد 159