نوآوری و تحول برای استاندارد شدن آزمایش‌های ایمنوفلورسنس

• آزمایش ANA اساس و پایه تشخیص بسیاری از بیماری‌های اتوایمیون است.

• نقش ANA در بسیاری اختلالات و بیماری‌های اتوایمیون مانند 1) لوپوس آریتماتوز، 2) بیماری اتوایمیون روماتوئید سیستمیک، 3) بیماری بافت همبند مختلط، 4)سندرم شوگرن، 5) اسکلروز سیستمیک، 6) پلی میوزیت، 7) درماتومیوزیت و 8) سیروز اولیه صفراوی

• Systemic Lupus Erythematosus, SLE

• Systemic Autoimmune Rheumatic Disease, SARD

• Mixed Connective Tissue Disease, MCTD

• Sjogren’s Syndrome, SJS

• Systemic Sclerosis, SSC

• Polymyosits (PM)

• Dermatomyositis

• Primary biliary cirrhosis, PBS

• تشخیص و طبقه‌بندی ANA، اساس و پایه اصلی تشخیص و افتراق بیماری‌های اتوایمیون یاد شده می‌باشد.

• ANA اغلب با تکنیک و روش استاندارد ایمنوفلورسانس غیرمستقیم (IIFT) ردیابی می‌شود و با آزمایش‌های تخصصی و تکمیلی ELISA و ایمنوبلات تایید می‌شود. هرچند آزمایشANA  در آزمایشگاه‌های مختلف با گزارش‌ها و روش‌های متفاوت با استراتژی‌های متنوع انجام می‌شود.

 

روش استاندارد طلایی

تکنیک IIFT روی سلول‌های اپی‌تلیال انسانی روش استاندارد طلایی برای ردیابی ANA است. تایپ‌های مختلف ANA ویژگی‌های متنوعی از خود نشان می‌دهد که به موقعیت سلولی و رفتار و ویژگی آنتی‌ژن‌های هدف سلولی بستگی دارد. آنالیز و تحلیل و تفسیر الگوهای فلورسنس آزمایشگاه را قادر می‌سازد آنتی‌بادی یا آنتی‌بادی‌های حاضر در سرم بیمار را طبقه‌بندی کند و تشخیص افتراقی بیماری‌های اتوایمیون مربوطه را ممکن نماید.

با توجه به ساختار مولکولی و آنتی‌ژنی سلول‌های به کار رفته در روش IIFT، بیش از صد نوع اتوآنتی‌بادی متفاوت را می‌توان جداگانه تشخیص داد و تعیین تیتر نمود. گاهی اتوآنتی‌بادی‌هایی ردیابی می‌شوند که تاکنون شناخته نشده‌است و ارتباط آن با بیماری‌های خاصی تعریف نشده است. منفی شدن آزمایش ANA وجود هرگونه اتوآنتی‌بادی‌های مربوط به بیماری‌های یاد شده را قاطعانه رد می‌کند.

علاوه بر سلول‌های HEP.2[1] نوعی دیگر به نام HEP.20-10 نسبت بالایی از فاز میتوز سلولی را دارند که این ویژگی آنتی‌ژن‌های اختصاصی ویژه و پیچیده داخل هسته‌ای بیشتری را پدیدار می‌کند که می‌توان با تکنیک ایمنوفلورسنس ردیابی کرد.

آنتی‌ژن‌های منفرد اختصاصی مانند SS-A، SS-B، SCL-70، JO-1، Ribosomal.p.Proteins و RNP/sm,sm با تکنیک‌های ویژه‌ای تخلیص شده اند و در قالب روش تشخیص جدیدی به نام Antigen Dots یا EUROPLUS طراحی شده اند.

با روش EUROPLUS، آنتی‌ژن‌های اختصاصی در کنار سلول‌های HEP.2 روی اسلایدهای آزمایشگاهی قرار داده شده است که امکان بررسی و تشخیص آنتی‌بادی‌های اختصاصی با استفاده از آنتی‌ژن‌های ویژه به موازات یکدیگر میسر شده‌است، که این تکنیک خاص نیاز به انکوباسیون و انجام مجدد آزمایش‌های تاییدی را به حداقل رسانیده است.

 علاوه براین آنالیز الگوی فلورسنس سلول‌های Primate Liver در کنار سلول‌های HEP.2 اطلاعات فوق‌العاده ارزشمندی در ارتباط با نتایج ANA. IIFT را فراهم می‌سازد.مقایسه الگوی فلورسانس دو سلول متفاوت (سوبسترا) نتایج آزمایش ANA را به صورت شگفت‌انگیزی تصحیح و قابل قبول می‌کند.استفاده از سلول‌های Primate Liver به شناسایی اتوآنتی‌بادی‌های خاص و تشخیص غیر منتظره یک بیماری کمک می‌کنداین تکنولوژی Mosaic Biochip  نام دارد.

 

مروری بر معیارهای طبقه‌بندی ICAP[2] برای ANA

اصطلاح چتر برای ANA دلیلی تاریخی دارد و بر می‌گردد به ردیابی آنتی‌بادی‌های سلولی که با سلول HEP.2 تشخیص داده می‌شود. طبق معیارهای ICAP یا (چتر ICAP) سه دسته بندی اصلی برای آنتی‌بادی‌های ضد هسته‌ای (ANA) وجود دارد.

• Nuclear (True ANA) Fluorescence Pattern

• Cytoplasmic Fluorescence Pattern

• Mitotic Fluorescence Pattern

هر دسته الگویی به گروه و زیرگروه‌های مشخص تقسیم می‌شود که یک درخت طبقه‌بندی جامع را شکل می‌دهد. هر الگو و زیرالگوی ایمنوفلورسنس ANA یک کد اختصاصی دارد به نام Anti-Cell (AC) که از AC-1 تا AC-28 نامگذاری می‌شوند.علاوه بر آن الگوهای گزارش ایمنوفلورسنس به دو سطح زیر هم تقسیم می‌شوند.

1. Competent Level

2. Expert Level

نوع گزارش‌ها به شیوع بالینی و تشخیص آسان و مفید آن‌ها بستگی دارد. نوع سطح گزارش در واقع در بستری شناور تعریف می‌شود که به بازخوردهای متخصصینی که از نتایج این گزارش‌ها بهره می‌برند بستگی دارد.

الگوی True ANA; Nuclear

الگوهای هسته‌ای (Nuclear) بر مبنای رنگ گرفتگی هسته سلول در مرحله اینترفاز[3] سلول‌های HEP.2 تعریف می‌شود. فهرست الگوهای هسته‌ای به طور اولیه به واکنش رنگ پذیری نوکلئوپلاست مانند (Homogenous یا Speckle و اجزای اصلی نوکلئوپلاسم مانند centromeres، ذرات هسته‌ای بستگی دارد.الگوهای ANAهسته‌ای شامل انواع زیر می‌باشد:

1. Homogenous

2. Speckled

3. Centromere

4. Discrete Nuclear Dots

5. Nuclear

6. Nuclear Envelope

7. Pleomorphic Patterns

الگوی هسته‌ای DFS70 جزئی از گروه Speckled است.و الگوی Centromere زیرگروهی از Discrete Nuclear می باشد. هرچند گروه بندی آن به ویژگی‌های اختصاصی الگوی فلورسانس و شیوع بالینی آن بستگی دارد.الگویANA هسته‌ای خود به گروهای دوتایی زیر تقسیم می‌شود:

• Fine or Large Speckle / Coarse Speckled

• Multiple or Few Nuclear Dots

• Homogenous / Clumpy or Punctate Nucleolar

• Smooth or Punctate Nuclear Envelope

• PCNA-like or CENP-F-like Pleomorphic Pattern

 

الگوی ANAهسته‌ای اطلاعات ارزشمندی درباره آنتی‌ژن‌های هدف سلولی و تشخیص بیماری‌های احتمالی (جدول 1) مطرح می‌سازد.برای مثال الگوی Homogeneous گویای واکنش آنتی‌بادی‌های ایجاد شده با اجزای کروماتینی هسته مانند ds-DNA، هیستون و نوکلئوزوم می‌باشد. این اتوآنتی‌بادی‌ها معمولاً در بیماری SLE، لوپوس القایی ناشی از دارو و آرتریت ایدیوپاتیک جوانان[4] مشاهده می‌شود. دیگر واکنش‌های هسته‌ای می‌توان در تشخیص بالینی بیماری‌هایی چون MCTD، SJS، SSC، PM، DM، PBC یا دیگر بیماری‌های اتوایمیون کمک شایانی بنماید.

الگوهای مختلط [5] در صورت وجود بیش از یک اتوآنتی‌بادی در سرم بیماران مشاهده می‌شود. برای مثال اتوآنتی‌بادی‌های Centromere (Nuclear) و Mitochondrial Cytoplasmic که اغلب در PBC که در بیماری PBC ظاهر می‌شوند.

الگوی سیتوپلاسمیک:

الگوی سیتوپلاسمیک در هر نوع رنگ گرفتگی سیتوپلاسم سلول HEP.2 دیده می‌شود.

دسته بندی اولیه بر مبنای واکنش رنگ فلورسانس با اجزاء سیتوپلاسم سلول مانند (fibrillary or speckled) و ساختار سیتوپلاسم مانند Rods و Rings می‌باشد. الگوهای اصلی سیتوپلاسمی عبارتند از:

• Fibrillary

• Speckled

• Reticular Mitochondrion-like (AM)

• Polar/Golgi-like

• Rods & Rings

الگوی fibrillary به سه دسته زیر تقسیم‌بندی می‌شود:

• Linear

• Filamentous

• Segmental

الگوی Speckled به سه دسته زیر تقسیم بندی می‌شود:

• Discrete Dots

• Dense Fine Speckled

• Fine Speckled

اتوآنتی‌بادی‌های سیتوپلاسمیک با ویژگی‌های متفاوت در بیماری‌های MCTD، PM، DM، SLE، SSC، PBC، بیماری کولیت اولسراتیو، میاستنی گراویس و بیماری کرون دیده می‌شود.

الگوی سیتوپلاسمیک باید در گزارش بیماران حتماً معرفی شود و هیچگاه به عنوان یک ANA منفی تلقی نگردد.

 

الگوی میتوتیک Mitotic

الگوی میتوتیک نشانگر آنتی‌بادی علیه اجزاء اصلی سلول که در فاز میتوز ظاهر می‌شوند، است. الگوی میتوتیک شامل دسته‌های:

1. Centrosomes

2. Spindles Fibers with Subpattern Nuclear Mitotic Apparatus (NUMA)

3. Intercellular Bridge

4. Mitotic Chromosome Coat

بعضی از الگوهای میتوتیک مانند Centrosomes به طور مطلق با میتوز سلولی همراه نیست اما در نمای سلول‌های میتوتیک به طور مشخص دیده می‌شود.

آنتی‌بادی‌های میتوتیک نادر می‌باشد، ولی در برخی بیماری‌ها مانند SSC، SLE، SJS و پدیده رینود (جدول 3) دیده می‌شوند.

تایید نتایج آزمایش‌های IIFT با تکنولوژی پیشرفته LINE BLOT

نتیجه مثبت غربالگری ANA IIFT همیشه باید با آزمایش‌های تکمیلی و تخصصی دیگر تایید شود.

یک پیگیری ایده‌آل می‌تواند تکنیک Euroline ANA Profile 23 که امکان تشخیص افتراقی و تایید بسیاری از بیماری‌های اتوایمیون سیستمیک را ممکن می‌سازد، باشد.

این آزمایش شامل آنتی‌ژن‌های اختصاصی زیر می‌باشد :

Ds DNA, Nucleosomes, Histones, SSA, RO-52, SS-B, RNP/SM, Mi-2α, Mi-2β, KU, CENP-A, CENP-B, sp100, PML, SCL70, PM-SCL100, PM-SCL75, RP11, RP155, gp210, PCNA & DFS-70.

این پروفایل تشخیصی گسترده نخستین مرحله تاییدی آزمایش ANA می‌باشد که تمام الگوهای هسته‌ای و به طور جامع پوشش می‌دهد.

آنتی‌ژن‌هایی که روی غشاء تراشه‌ای تعبیه شده است می‌تواند با اطمینان نتایج ایده‌آل و بسیار قابل اعتمادی را در تایید آنتی‌بادی‌های بیماری‌های اتوایمیون مربوطه ارایه نماید.

روش پروفایل ELISA می‌تواند حدود 11 نوع آنتی‌بادی اختصاصی را شناسایی نماید  که با نام ENA-ELISA گاهی به عنوان روش های تاییدی مورد استفاده قرار می گیرد.

چشم انداز

ICAP در تلاش است که برای استاندارد نمودن گزارش ANA طبقه‌بندی و معیارهای قابل قبولی را ارایه نماید. چشم انداز آینده طبقه‌بندی استاندارد الگوهای Mixed مانند SCL70-like و الگوهای نادر می‌باشد.