آزمایش ANA

اتوآنتی‌بادی‌های ضدهسته ای 

اتوآنتی‌بادی‌های ضد هسته‌ای مستقیماً علیه آنتی‌ژن‌ها  و ترکیبات هسته سلول های یوکاریوت ها ساخته می‌شوند. نام‌گذاری این آنتی‌بادی‌ها بر مبنای معیارهای زیر است:

1. ویژگی‌های بیوشیمیایی آن‌ها مانند آنتی‌بادی ضد DNA، هیستون، ریبونوکلئوپروتئین (RNP) و...

2. بیماری‌هایی که با این اتوآنتی بادی‌ها همراه‌اند مانند: آنتی SS-A، آنتی SS-B، سندرم شوگرن ، PM-SCL (پلی‌میوزیت و سیستمیک اسکلروز پیشرونده)

3. نام نخستین بیمار که این آنتی‌بادی‌ها در آن‌ها کشف شدو یا اولین افرادی که این آنتی بادی ها  را کشف کردند: SM، Ro، La.

نکته: بیش از 100 نوع اتوآنتی‌ژن در سلول‌های HEp-2 وجود دارد که با آزمایش ANA  و روش های استاندارد آن ردیابی می شوند.  مهم‌ترین آن‌ها عبارتند از:

 

More than 100 autoantigens are presented in HEp-2 cells. The most important among them are:
Polynucleotides	Double-stranded DNA (dsDNA), single stranded DNA (ssDNA), RNA
Histones	H1, H2A, H2B, H3, H4, H2A-H2B complex
Ribnucleoproteins	U1-(n)RNP, Sm, SS-A (Ro), SS-B (La)
Nucleolar antigens	U3-(n)RNP/fibrillarian, RNA polymerase I, PM-Scl (PM-1), 7-2 RNP (To), 4-6-S-RNA, NOR-90 Nucleolar organizer regions
Centromeres	Kinetochore proteins
Other proteins	Scl-70,PCNA (cyclin 1),nuclear granules, Ku, Mi-2, lamins, lamin receptors

 

آزمایش ANA با روش IIFT، روش استاندارد و قابل اعتماد

انجام آزمایش ANA با روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم یا IIFT (Indirect Immuno Florescence Test) بالاترین ویژگی و حساسیت را با استفاده از سلول‌های HEp-2 انسانی و کبد میمون به عنوان روش استاندارد طلایی ردیابی و تشخیص اتوآنتی‌بادی‌های ضد هسته‌ای دارد. استاندارد طلایی برای آزمایش ANA  روشIIFT ایمونوفلورسانس غیر مستقیم می باشد.

درروش IIFT با استفاه از ترکیبات رنگ فلورسنس (فلوئورسین) می‌توان پس از تشکیل کمپلکس آنتی‌ژن-آنتی‌بادی شدت رنگ را با میکروسکوپ فلورسنس ارزیابی نمود. در آزمایش فلورسانس غیر مستقیم برای انجام آزمایش ANA اتصال هرنوع آنتی‌بادی به آنتی‌ژن مربوطه، الگوی فلورسنس مشخصی را ایجاد می‌کند که بر اساس جایگاه اتوآنتی‌ژن مربوطه متفاوت می‌باشد. این آنتی ژن ها می توانند هستکی (Nucleolar Ags) یا سیتوپلاسمی (cytoplasmic Ags) باشند. 

اگر آزمایش ANA مثبت شد، لازم است نتیجه آزمایش با روش‌های تکمیلی و تاییدی  اختصاصی که بر مبنای آنتی‌ژن‌های منفرد خالص، طراحی شده است تائید شود؛ روش‌هایی مانند ELISA،  Western Blotو Line Blot.

 

 

Autoimmune disease	ANA Prevalence(%)
Systemic lupus erythematosus  (SLE)              بیماری لوپوس اریتماتوز	100-95
Drug-induced lupus erythematosus            بیماری لوپوس القا شده با دارو	100
(Mixed collective tissue disease (MCTD, Sharp syndr. بیماری اتوایمیون بافت همبند	100
Rheumatoid arthritis آرتریت روماتوئید	20-40
Other rheumatic diseases دیگر بیماری های روماتوئیدی	20-50
Progressive systemic sclerosis بیماری سیستمیک اسکلروز پیشرفته	85-95
Polymyositis/dermatomyositis پلی میوزیت و درماتومیوزیت	30-50
Sjogren’s syndrome سندرم شوگرن	70-80
Autoimmune hepatitis هپاتیت اتوایمیون	30-40
Ulcerative colitis کولیت اولسروز-اولسراتیو	26

 

آزمایش ANA و کاربرد بالینی 

آنتی‌بادی‌هایANA در بسیاری از بیماری‌های خودایمنی ظاهر می‌گردند.ردیابی و سنجش اتوآنتی‌بادی‌های ضد هسته سلول با آزمایش ANA روش بسیار مهمی برای تشخیص طیف گسترده ای از بیماری‌های اتوایمیون می‌باشد. آنتی‌بادی‌های ضد آنتی‌ژن‌های مختلف هسته‌ای علیه ترکیبات گوناگون داخل هسته تشکیل می‌شوند که این آنتی‌ژن‌ها عمدتاً عبارتند از :                 

1. اسیدهای نوکلئیک      

2. پروتئین‌های هسته سلول   

3. ریبونوکلئوپروتئین‌ ها 

 

 

 

2                                         1                            

بیماری سیستمیک لوپوس اریتروماتوز؛ SLE

ردیابی و تشخیص آنتی‌بادی ضد ds-DNA مهمترین معیار تشخیص بیماری سیستمیک لوپوس اریتروماتوز  (SLE) یا LED) Lupus Erythematosus Disseminatus) می‌باشد. کمپلکس‌های ایمنی ds-DNA و اتوآنتی‌بادی‌های مربوطه اغلب باعث آسیب‌های بافتی متعددی در زیر پوست، کلیه‌ها، مغز و سایر بافت‌ها می‌شود. تیتر آنتی‌بادی با فعالیت و پیشرفت بیماری تغییر می‌کند.آنتی‌بادی‌های ضد نوکلئوزوم و Sm به عنوان شاخص بیماری زایی  SLE تلقی می‌شوند. آنتی‌بادی ضد پلی‌نوکلئوپپتیدها، ریبونوکلئوتیدها، هیستون ها و دیگر آنتی‌ژن‌های هسته‌ای در  بیماری لوپوس قابل ردیابی و تشخیص  می باشد. آزمایش ANA  با روش IIFA  در 80 تا 100% مبتلایان به لوپوس مثبت می شود و تیتر آنتی بادی و الگوی فلورسانس آن در روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم بسیار متنوع و متغییر می باشد. شایع ترین الگوی ایمونوفلورسنس آزمایش ANA برای تشخیص SLE، الگوی هموژنوس می باشد.

 الگوی هموژنوس در بیماری SLE

در بیماری لوپوس اریتروماتوز دارویی Drug-induced lupus علایم بالینی چون آرترالژیا، آرتریت، گزانتما، سروزیت، میالژیا، هپاتومیالژیا و اسپلنومگالی و آنتی‌بادی علیه هیستون هسته‌ای همراه می شود. در تمام موارد بالا، آزمایش ANA  مثبت است. شکل برگشت پذیر SLE می‌تواند با مصرف داروهای زیر تظاهر نماید:

آنتی‌بیوتیک‌هایی چون (پنی‌سیلین، استرپتومایسین، تتراسیکلین)، داروهای شیمی‌درمانی (مانند INH، سولفونامید)، ضد تشنج‌ها (فنی‌توئین، هیدرانتوئین‌ها)، ضد آریتمی‌ها (مانند پروسینامید، پراکتولون)، ضد فشارخون (رزرپین، هیدرالازین)، سیکوتروپ‌ها (کلروپرومازین)، آنتی تیروئیدها (تیوراسیل)، آنتی روماتوئیدها (ترکیبات طلا، D پنی‌سیلین آمین)، ضدبارداری‌های خوراکی و آلوپورینول.

 نکته: آزمایش استاندارد طلایی برای تشخیص بیماری لوپوس، آزمایش Anti-dsDNA  با روش الایزا  NcX می باشد؛ دیگر روش ها مانند ایمونوفلورسانس غیر مستقیم  (CLIFF) و رادیو ایمونواسی (RIA) هم در این مورد کاربرد دارد.

Autoantibodies in systemic Lupus erythematosus
(%) Prevalence	Antigen
60-90	Double-stranded DNA
70-95	Single-stranded DNA
50-95	Nucleosomes
50	RNA
6	RNA helicase A
50-80	Histones
15-40	U1-nRNP
5-40	Sm
20-60	SS-A (Ro)
10-20	SS-B (La)
3	PCNA-like
10	Ku
10	Ribosomal P-proteins

 

 

بیماری بافت همبند مختلط؛ (MCTD) Mixed Connective Tissue Disease

اتوآنتی‌بادی اختصاصی بیماری MCTD ( بیماری مختلط بافت همبند) یا سندرم Sharp ، ضد U1-nRNP  در آزمایش ANA  با سلول های HEp -2 یک الگوی هسته ای ایجاد می کند. تیتر آزمایش ANA و الگوی فلورسانس مربوطه  با پیشرفت بیماری تغییر می‌کند.

 الگوی فلورسنس در حضور آنتی ژن  U1-nRNP

Autoantibodies In Mixed Connective Tissue Disease
Antigen	(%) Prevalence
U1-nRNP	95-100
Single-stranded DNA	20-50

 

آرتریت روماتوئید؛ (RA) Rheumatoid Arthritis

در آرتریت روماتوئید، آنتی‌بادی ضد هیستون‌ها را می‌توان در نیمی از بیماران ردیابی نمود، در حالی که در موارد نادری می‌توان آنتی‌بادی U1-nRNP را هم یافت. آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن هسته‌ای آرتریت روماتوئید: RANA (Rheumatoid arthritis nuclear Antigen) قابل تشخیص روی سلول‌های HEp-2 نمی باشد . آزمایش ANA  با روش IIFT در  حدود 20-40 % موارد مثبت می شود. آزمایش RANA  با روش های ELISA و اشترلونی قابل ردیابی است. 

Anti-nuclear-antibodies in rheumatoid arthritis
(%)Prevalence	Antigen
15-50	Histones
8	Single-stranded DNA
3	U1-nRNP

 

بیماری سیستمیک اسکلروزیس پیشرونده؛ (PSS) Progressive Systemic Sclerosis

آزمایش ANA  با الگو های فلورسانس اختصاصی در 85 تا 95 % موارد PSS  یافت می شود. بیماری PSS به دو شکل محدود شونده (Limited Form) و گسترش یابنده (Diffuse Form) بروز می‌کند، که اغلب نمی توان این دو را از هم بازشناخت. تا کنون فقط آنتی‌بادی‌های ضد fibrillarin، RNA Polymerase و Scl-70 برای تشخیص نوع پیشرونده به کار می‌رود. تنها آنتی‌بادی که در شکل محدود شونده PSS قابل تشخیص است آنتی بادی ضد Centromeres است. این آنتی بادی های اختصاصی همراه با آزمایش ANA با روش های تائیدی ELISA  وline Blot  قابل رد یابی است.

 الگوی سانترومریک در فرم محدود بیماری PSS

Autoantibodies In Progressive Systemic Sclerosis (Limited Form(
Antigen	(%) Prevalence
Centromeres	80-95

 

Autoantibodies In Mixed Connective Tissue Disease (Diffuse Form(
Antigen	(%) Prevalence
Fibrillarian	5-10
PM-Scl (PM-1): (75kDa/100 kDa main antigen)	13(10/7)
Scl-70	25-75
RNA polymerase I	4
Ku, incl, overlap syndrome with PM/MD	25-50
7-2 RNP (To)	Rare
NOR-90 (nuclear organizer region)	Rare

 

پلی‌میوزیت/درماتومیوزیت Polymyositis/ Dermatomyosis (PM/DM)

آزمایش ANA با روش IIFT  در 30 تا 50 % موارد پلی‌میوزیت و درماتومیوزیت مثبت می شود. اتوآنتی‌بادی‌های ضد PM-SCL در پلی‌میوزیت و درماتومیوزیت قابل ردیابی است. دیگر اتوآنتی‌بادی‌های ضد هسته‌ای (Mi-1, Mi-2, KU)و آنتی‌بادی ضد JO-1 نیز در این بیماری‌ها قابل تشخیص است.این آنتی بادی های اختصاصی علاوه بر آزمایش ANA روی سلول های HEp-2  با روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم با روش های تائیدی ELISA  و Line Blot  قابل ردیابی و تشخیص می باشد.

 الگوی فلورسنت ایجاد شده در حضور آنتی ژن PM-Scl

Autoantibodies in Polymyositis and Dermatomyosis
Antigen	(%) Prevalence
PM-Scl (PM-1), incl. overlap syndrome PSS	55-24
Jo-1 (histdyl-tRNA synthetase)	35-25
Mi-1	10
Mi-2	30-5
Ku, incl. overlap syndrome	50-25
Single-stranded DNA	40-50
SRP	5
TIF1-gamma	5
PL-7, PL-12 (aminoacyl-tRNA synthetase)	4-3

 

سندرم شوگرن Sjogren’s Syndrome (SS)

آزمایش ANA با روش IIFT  در 70 تا 80 در صد موارد سندرم شوگرن مثبت می شود. اتوآنتی بادی های  ضد SS-A و SS-B معمولا در همراهی با یکدیگر قابل ردیابی  هستند؛ علاوه بر آن اتوآنتی‌بادی ضد مجاری‌ ترشحی بزاق را در 40 تا 60 درصد موارد می‌توان یافت.

الگوی فلورسنت ایجاد شده در حضور آنتی ژن های SS-A و SS-B

Autoantibodies in Sjogren’s Syndrome
Antigen	(%) Prevalence
SS-A (Ro)	40-95
SS-B (La)	40-95
Single-stranded DNA	13
RANA	70
Salivary excretory ducts	40-60
Rheumatoid factors	60-80

 

نکته:  با گسترش سلولی تک لایه از بافت غده پاروتید و بررسی الگوی فلورسنسی آن میتوان اتو آنتی بادی ضد مجاری ترشحی بزاق را تشخیص داد.

 

سیروز اولیه صفراوی (PBS) Primary Biliary Cirrhosis;

آزمایش ANA با روش IIFT  در 30 تا 40 %موارد هپاتیت اتوایمیون یا Autoimmune Hepaitis AIH) )، مثبت می شود. در بیماری سیروز اولیه صفراوی علاوه بر آنتی‌بادی ضد میتوکندری(AMA)، اتوآنتی‌بادی‌های متنوعی علیه هسته سلول نیز قابل ردیابی است. برخی از آن‌ها می‌توانندپاتوگنومونیک (Pathognomonic ) باشند. گذشته از این آنتی‌بادی ضد SS-A و سانترومرها نیز در برخی موارد PBC قابل ردیابی است. حضور   آنتی‌بادی‌های ضد gp210 پیش آگهی بدی درتشخیص سیراین بیماری دارد.

شکل AMA الگوی فلورسنس ایجاد شده در حضور

Anti-nuclear Autoantibodies in primary biliary cirrhosis
Antigen	(%) Prevalence
AMA-M2	95
Nuclear dots	25-40
Nuclear membrane	20-40
SS-A	20
Centromeres	20-30

 

نکته: آزمایش ANA در حدودا 5 % افراد سالم مثبت است.  اتوآنتی‌بادی ضد هسته‌ای را می توان بدون هیچ علامت بالینی ردیابی نمود که این آنتی بادی ها عمدتاً از کلاس IgM می‌باشند.

 الگوی فلورسنس آنتی بادی ضد میتوکندری

 

آزمایش ANA  و بیماری های مرتبط

Anti-nuclear autoantibodies; The most important associated diseases
Antigen	Disease	(%) Prevalence
dsDNA	Systemic lupus erythematosus (SLE)	60-90
ssDNA	SLE	70-95
	Drug-induced SLE	60
	MCTD (Sharp syndrome)	20-50
	Polymyositis/Dermatomyositis	40-50
	Progressive systemic sclerosis (PSS)
	Sjogren’s syndrome, rheum. Arthritis	8-14
RNA	SLE	50
	PSS, Sjogren’s syndrome	65
Histones	Drug- induced SLE	95
	SLE	50-80
	Rheumatoid arthritis	15-50
U1-nRNP	MCTD(sharp syndrome)	95-100
	SLE	15-40
	Rheumatoid arthritis	3
Sm	SLE	5-40
SS-A (Ro)	Sjogren’s syndrome	40-95
	SLE	20-60
	Neonatal lupus syndrome	100
SS-B(La)	Sjogren’s syndrome	40-95
	SLE	10-20
Fibrillarin	PSS, diffuse form	5-10
RNA polymerase I	PSS, diffuse form	4
RNA helicase A	SLE	6
PM-Scl(PM-1)	Poly -/dermatomyositis /overlap syndr.	55-24
	PSS, diffuse form	13
Centromeres	PSS, limited form	80-95
Scl-70	PSS, diffuse form	25-75
PCNA-like	SLE	3
Ku	SLE	10
	Poly-/ dermatomyositis , PSS	50-25
Mi-1, Mi-2	Dermatomyositis	30-5

 

ارتباط بیماری‌ها با اتوآنتی‌بادی‌های اختصاصی بر ضد اجزاء سیتوپلاسمی سلول‌های  HEp-2 همیشه با آزمایش ANA و الگوهای ایمنوفلورسانس آن قابل ردیابی نمی‌باشند.فقط تعدادی از آنتی‌بادی‌های ضد سیتوپلاسمی ارتباط قاطعی با بیماری‌های شناخته شده اتوایمیون دارند که می‌توان به ارتباط آنتی‌بادی ضد میتوکندری (AMA) درکلانژیت اولیه صفراوی و آنتی‌بادی‌های JO-1، PL-7 و PL-12 در پلی‌میوزیت و درماتومیوزیت اشاره کرد.

آنتی‌بادی‌های نادر OJ، EJ و SRP Signal Recognition Particles گاهی در پلی‌میوزیت‌ها هم دیده می‌شود.سایر اتوآنتی‌بادی‌های ضد ریبوزوم‌ها، دستگاه گلژی، لیزوزوم‌ها و اجزاء سیتواسکلتون مانند Vimentin و Cytokeratins  نیز قابل ردیابی هستند ولی ارزش بالینی و تشخیصی چندانی ندارند.

 

اندامک های سلولی

جهت تشخیص الگوهای   ANAشناخت اندامک ها و مراحل میتوز در سلول های HEp ضروری به نظر می رسد. به همین منظور ساختار یک سلول یوکاریوتی و چرخه سلولی آن در زیر آورده شده است.

هسته سلول که از سیتوپلاسم به وسیله غشا جدا شده است. هسته، حاوی محتوای ژنتیکی سلول به شکل کروموزوم بوده و یک یا تعداد بیشتری اجسام هسته ای به نام هستک دارد.

هستک ها ساختارهای مدور حاوی ژن ها یا RNA ریبوزومی بوده و مسوول سوار کردن واحد های ریبوزومی هستند.

ریبوزوم ها: سنتز پروتئین ها در ریبوزوم ها رخ می دهد. ریبوزوم ها به صورت منتشر در سیتوپلاسم یا به صورت متصل به غشای شبکه اندوپلاسمی دیده می شوند.

شبکه اندوپلاسمی یک سیستم غشایی منشعب و متشکل از توبول ها و سیسترن ها می باشد. شبکه اندوپلاسمی خشن حاوی ریبوزوم بوده و مسوول سنتز پروتئین، شکل گیری ساختار فضایی پروتئین ها و تولید غشای سلولی است. شبکه اندوپلاسمی صاف فعالیت های گسترده ای شامل دخات در متابولیسم و بیوسنتز لیپید، استروئید و اسیدهای چرب دارد.

وزیکول ها ساختارهای کروی غشادار در سیتوپلاسم هستند که بسته به محتوای آنزیمی خود عملکرد های متفاوتی دارند.

دستگاه گلژی متشکل از توبول ها و وزیکولهای روی هم چیده شده است و عملکرد اصلی آن ترشح ترکیبات مختلف از سلول است. دستگاه گلژی همچنین در شکل گیری لیزوزوم ها دخیل است.

میتوکندری که مسوول تنفس سلولی و تولید انرژی در سلول است. میتوکندری دارای چندین لایه تا خورده از غشای داخلی و خارجی در ابعاد مختلف بسته به میزان نیاز سلول به انرژی است. میتوکندری دارای DNA اختصاصی خود ی باشد.

لیزوزوم ها ساختارهای کوچک غشادارهستند که در سیستم هضم سلولی ایفای نقش می کنند.

سیتوپلاسم حاوی مقادیر بالایی آب، اسکلت سلولی و اندامک های شرح داده شده در بالا است.

اسکلت سلولی مسوول حفظ شکل سلول است و شامل میکروفیلامان و میکروتوبول است.

میکروفیلامان ها ترکیبات رشته ای هستند که عمدتا از اکتین و میوزین تشکیل شده  و به صورت دسته ای وجود دارند.

میکروتوبول ها که ساختارهای لوله ای شکل بوده و در تمام سیتوپلاسم پراکنده اند.

سانتریول ها که متشکل از نه میکروتوبول موازی هم بوده و در تشکیل دوک های میتوزی حین تقسیم سلولی دخیل هستند.

مراحل تقسیم سلول

 

مراحل تقسیم سلولی به دو بخش کلی اینترفاز و میتوز تقسیم میشود. میتوز در واقع به مرحله تقسیم هسته سلول در سلولهای یوکاریوت اطلاق میشود. به دنبال میتوز تقسیم سلول یا سایتوکینز (Cytokinesis)  رخ می دهد که در طی این فرآیند، محتویات و پلاسمای سلول مادری بین دو سلول دختری که از نظر ژنتیکی یکسان هستند، تقسیم می شود. مرحله بین دو تقسیم هسته، به نام اینترفاز خوانده می شود.

اینترفاز: فاصله بین دو تقسیم سلولی متوالی که شامل مراحل G1، S و G2 است. در مرحله G1 سلول های دختری شروع به رشد می کنند. در مرحله S یا سنتز، DNA حاوی اطلاعات ژنتیکی تکثیر شده و سلول به حالت تتراپلوئید در می آید. در مرحله G2 سلول آماده میتوز بعدی می شود. کروماتین در اینترفاز تراکم کمی داشته و هستک ها اغلب مشاهده می شوند.

پروفاز: که آغاز میتوز محسوب می شود. در این مرحله کروماتین کوتاه و فشرده شده و به صورت رشته های کروموزومی متراکم در می آید. دوک های میتوزی تشکیل شده، غشای هسته به تدریج از بین می رود و هستک متلاشی می شود.

متافاز: کروموزوم های به شدت کوتاه شده، در ناحیه استوایی دوک های میتوزی، تجمع می کنند. کروماتیدها ( هر کدام از دو نیمه کروموزوم تکثیر شده)  مرئی شده و در راستای نقطه اتصال به دوک میتوزی ردیف می شوند.

آنافاز: دو کروماتید خواهری از طول جدا شده و به سمت دو قطب سلولی کشیده می شوند.

تلوفاز: تکامل تقسیم هسته سلول. کروموزوم های دختری به قطبین سلولی رسیده و غشای هسته جدیدی تشکیل می شود. در این مرحله سیتوپلاسم تقسیم می شود و سیتوکینز آغاز شده که در اینترفاز نیز ادامه دارد.

تشخیص الگوهای آزمایش ANA با تکنولوژی ایمونوفلورسانس غیر مستقیم (بخش سوم)

تشخیص الگوهای آزمایش ANA با تکنولوژی ایمونوفلورسانس غیر مستقیم (بخش دوم)