آنتی بادی های خودایمن بیماری های اختصاصی بافت پیوندی

فقدان تحمل ایمنی در بیماری های بافت پیوندی ( CTDs) همچون لوپوس اریتماتوز سیستمیک (SLE)، اسکلروزیس سیستمیک (SSc)، پلی/درماتومیوزیت (PM/DM)، سندرم شوگرن (SjS)، و بیماری های بافت پیوندی مختلط (MCTD) باعث بوجود آمدن نسلی از انواع آنتی بادی های خودایمن غیر اختصاصی عضو می گردد. اگرچه عوامل تحریک کننده برای بوجود آمدن آنتی بادی های خودایمن و نقش شان در بیماریزایی بیماری های بافت پیوندی هنوز بطور کامل شناخته نشده است، آنتی بادی های خود ایمن امروزه بطور وسیعی بعنوان مارکرهای تشخیصی در زمینه های بالینی بکار میروند. پدیده سلولهای L.E.  که توسط هارگراویس در اواخر دهه 1940 در بیماران دچار SLE توضیح داده شد، ثابت نمود که بیماری در نتیجه اتصال آنتی بادی های خود ایمن  به اجزای هسته ای ایجاد شده و این موضوع شروعی برای استفاده از آنتی بادی های خود ایمن در تشخیص های بالینی بود. ایمونوفلورسنت غیرمستقیم (IIF) اولین تکنیک آزمایشی بکارگرفته شده برای کشف آنتی بادی های خود ایمن  در بیماران دچار CTD بود. کارهای خلاقانه و پیشگامانه هالبرو و فریو و همکارانش منجر به کشف آنتی بادی هایی شد که آنتی بادی های ضد هسته ای (ANAs) نامگذاری شده و بعنوان مارکرهای تشخیصی خودایمنی در بیماری های CTD از جمله SLE معرفی گردید. در سالهای بعدی، متخصصین اقدامات عظیمی در جهت فهم اهمیت بالینی آنتی بادی های خود ایمن و استفاده بالقوه شان برای تشخیص سرولوژیکی بیماری های CTD و فراتر از آن انجام دادند. (عکس 1،جدول 1).

قابل ذکر است که ANA تعیین شده بوسیله روش IIF بعدها جزو شاخص های تشخیصی در SLE و هپاتیت خودایمن (AIH) گردید. در همین راستا، کشف آنتی بادی های خودایمن علیه آنتی ژن های هسته ای قابل استخراج (ENAs) جدا از آنتی بادی های خودایمن علیه dsDNA و هیستون ها در جستجو برای آنتی بادی های خودایمن اختصاصی بیماری ، مثال جالبی را برای تغییر فهم معنای بالینی آنتی بادی های خودایمن بعنوان مارکرهای تشخیصی فراهم آورد. بنابراین، مقاله تن و کانکل در تعیین Sm بعنوان هدف اتوآنتی ژنیکی برای SLE و کاربرد double radial immunodiffusion (DRID;Ouchterlony technique) در تعیین آن، مرحله جدیدی را در روش های تشخیصی به وسیله آنتی بادی های خودایمن و کاربردهای بالینی شان ایجاد نمود. اگرچه مشخص گردید که ANA مارکر حساسی برای کل گروه بیماری های SARD می باشد، ویژگی آن برای تمایز بیماری های SARD راضی کننده نبود (هرچند بعنوان مارکر تشخیصی برای SLE تعیین شده بود) . بنابراین نیاز بالینی به یک "ANA" اختصاصی تر بوسیله تلاشهای تن و کانکل و اکتشافات بیشتر و بیشتر آنتی بادی های خودایمن جدید علیه ENA و اهمیت بالینی شان توسط دیگران برطرف گردید. اما، تمامی ENAs که بعنوان هدف برای آنتی بادی های خودایمن اختصاصی CTD شناخته شده بودند را نمی توان بوسیله تکنیک استخراج سالین که قبلا گزارش شده بود جدا نمود. علاوه براین، بغیر از آنتی بادی های خودایمن که آنتی ژن های خودایمن هسته ای را می شناسند، آنتی بادی های خودایمن علیه سیتوپلاسم (ACyA)  در پانل آنتی بادی های خودایمن برای آزمایش های سرولوژی SARD معرفی شدند. بنابراین، نشان داده شده که آنتی بادی های خودایمن anti-SjS antigen A (SS-A) که Ro نیز نامیده می شوند با مولکول هدف مربوطه خود در سیتوپلاسم واکنش می دهند. در حقیقت، پیشرفت در علم پروتئین شناسی، شناسایی اهداف اتوآنتی ژنیک سیتوپلاسمی و واکنش شان  را امکان پذیر می نماید، بعنوان مثال واکنش آنتی بادی های خودایمن اختصاصی میوزیت مانند آنتی بادی های anti-hystidyl tRNAse (Jo-1) یا آنتی بادی های اختصاصی SLE علیه پروتئینهای ریبوزومی را مقدور ساخته است. بطور مشخص، این موضوع باعث سردرگمی بین متخصصین بالینی و آزمایشگاهی گردید و روشن شدن آن مورد نیاز بود. در مورد آزمایش ANA، معرفی سلولهای کارسینوم حنجره اپیدرموئید انسان(HEp-2) بعنوان ماده اتوآنتی ژن در روش IIF گزارش الگوهای سیتوپلاسمی اختصاصی CTD را در طول سالها بهبود بخشیده است. این تناقض در نامگذاری توسط توافق اخیر که استفاده از آنتی بادی های آنتی سلولار را به جای ANA توصیه میکند برطرف گردید. با این وجود، استفاده از ANA و ENA بخصوص بین متخصصین بالینی به خوبی پایه گذاری شده و باید دید چه موقع این مسئله در سالهای آتی حل خواهد شد. بطور خلاصه، آزمایش آنتی بادی های خودایمن بخش جدایی ناپذیری در تشخیص های سرولوژیکی برای CTD می باشد و ممکن است در پیش آگهی ، طبقه بندی، و پیگیری فعالیت بیماری نیز کمک کننده باشد.     

 

 

همانطور که قبلاً اشاره گردید، نه تنها کشف آنتی بادی های خودایمن جدید اختصاصی SARD مهارت های تشخیصی متخصصین بالینی، بلکه معرفی روشهای جدید آزمایشی با عملکردهای متفاوت را نیز به چالش کشید. بنابراین، تغییر از تکنیک های تعیین براساس ایمونودیفیوژن همچون DRID یا کانترایمونوالکتروفورز (CIE) به آزمونهایی چون الایزا برای آنالیز آنتی بادی های خودایمن علیه Sm یا  SS-A باعث گردید ویژگی این مارکرها زیر سوال برود.  الایزای فاز جامد حساسیت قابل توجه بیشتر و در عین حال ویژگی کمتری را دارا می باشد. علاوه براین، با فهم بهتر از ساختمان شیمیایی، بعنوان مثال کمپلکس ریبونوکلئوپروتئین هسته ای کوچک (snRNP) که اتوآنتی ژن Sm را ارائه میدهد، 6 ساختمان پروتئینی مختلف (B,B’,D,E,F,G) بعنوان تارگتهای اتوآنتی ژنی که از بین آنها SmD ظاهراً اختصاصی ترین شان برای SLE می باشد، شناخته شد. این جنبه های انتقادی نیازمند دانش جامعی برای تفسیر خصوصیات متدهای آزمایش بوسیله متخصصین بالینی است که قبلاً توسط آزمایشگاهها به اندازه کافی در دسترس قرار نمی گرفت. تفاسیری که توسط خود متخصصین بالینی از آزمایشاتی همچون ANA و رابطه آن با بیماری ها انجام می گرفت نیز چندان راضی کننده نبود. بنابراین، استراتژی های جدید تشخیصی که پیشرفت را در آزمایش آنتی بادی های خودایمن نشان می دهند، به سختی با مسیرهای تشخیصی ثابت شده سازگار بود. تلاش های اخیر برای جایگزینی آزمایش ANA به روش IIF بعنوان آزمون غربالگری با استراتژی دو-تیتری با تکنیکهای چندگانه جدید با شکست مواجه شد و یا با مقاومت زیاد روماتولوژیست ها علیه آن روبرو گردید. متعاقباً، استراتژی دو مرحله ای پیشنهادی انجام ANA با روش IIF بعنوان غربالگری و تایید ANA های مثبت با استفاده از آنالیزهای مختلف توسط داوران متخصص در زمینه CTD اخیراً تصویب گردید. 

 

آنتی بادی های خودایمن اختصاصی واسکولیت خودایمن

همانند پدیده L.E. در بیماران دچار SLE ، بیماران دچار واسکولیت خودایمن نیز فقدان تحمل نسبت به پلی مورف ها را نشان دادند. آنتی بادی های خودایمن اجزای سیتوپلاسمی خاص نوتروفیل( نه اجزای غیراختصاصی هسته ای)، را شناسایی می کنند و اولین بار همراه با بیماری گلومرولونفریت در سال 1982 توسط داویس و همکارانش توصیف شدند. گروه وان دوود گزارش دادند که آنتی بادی هایی با نام آنتی بادی های علیه سیتوپلاسم نوتروفیل (ANCAs) در گرانولوماتوز همراه با پلی آنژیت (GPA، که قبلاً بنام گرانولوماتوز وگنر شناخته می شد) دیده می شود و متعاقباً در مدت کوتاهی واژه واسکولیت های وابسته به آنکا (AAV) ابداع گردید. بنابراین، این گروه از اختلالات واسکولار خودایمن شامل GPA، پلی آنژیت میکروسکوپی (MPA)، و گرانولوماتوز ائوزینوفیلی همراه با پلی آنژیت (EGPA، قبلاً سندرم شارگ-استراوس نامیده می شد) بودند. مشخصه بالینی بارزشان التهاب میکروواسکولارها، نکروز بافتی، و ظهور آنتی بادی های آنکا می باشد.

بطور جالب توجهی، مشابه آزمایشANA، روش IIF اولین روش بکار گرفته شده در تعیین آنتی بادی های آنکا بود که دو نوع الگوی سیتوپلاسمی (cANCA) و پری نوکلئار(pANCA) را مشخص نمود. متعاقباً و در مدت کوتاهی بعد، هدفهای اتوآنتی ژنی اصلی نوتروفیل ها، یعنی پروتئیناز3 (PR3) و میلوپراکسیداز (MPO) کشف گردیدند. بدنبال آن، استراتژی دو مرحله ای آزمایش  آنکا ،روش IIF را بعنوان روش استاندارد توسط مجمع بین المللی برای واسکولیت های وابسته به آنکا مشخص نمود. در واقع، آنالیز بی اندازه حساس آنتی بادی های خودایمن با استفاده از ماده زمینه سلولی توسط روش IIF ، این روش را بعنوان ابزار ایده آلی برای مرحله غربالگری و به دنبال آن تایید آزمایش با تکنولوژی های آزمونی ایمونولوژیک مختلف معرفی نمود. اما، مشابه خوانش ANA به روش IIF، تفسیر الگوهای آنکا بدلیل فقدان روشهای اتوماتیک مناسب و نیروهای با تجربه آزمایشگاهی بسیار وقت گیر می باشد. بدین ترتیب، IIF به طور کلی بسیار وابسته به فرد است که استانداردسازی مناسب را دشوار می سازد. بنابراین، تلاش برای جایگزینی روشIIF با تکنیکهای جدید ایمونواسی با فاز جامد (همچون الایزا، ایمونواسی dot/line، آزمون  addressable bead/microarray ) برای آنکا همانند آزمایش ANA ، اخیراً در حال افزایش است. در واقع، در مقایسه با روش IIF، این تکنیکها قابل اتوماسیون شدن هستند و نشان داده شده است که در آزمایشگاههای مدرن با توجه به افزایش تقاضای تشخیصی برای بیماری های خود ایمنی، از لحاظ هزینه به صرفه تر می باشند. اما، آمار نگران کننده ای از نتایج مثبت و منفی کاذب برای آزمایش های آنکا و همچنین ANA توسط این تکنیکها گزارش شده است. قابل توجه است که این حقیقت برای اختلالات خودایمن اختصاصی عضو همچون بیماری سیلیاک (CD) نیز صدق می کند.

 

آنتی بادی های خودایمن اختصاصی بیماری سلیاک

بیماری سیلیاک، بیماری روده کوچک مرتبط با گلوتن و با واسطه سیستم ایمنی، یکی از معدود اختلالات خودایمنی می باشد که عامل محرک آن شناخته شده است. در واقع، نشان داده شده که  پپتیدهای گلیادین دی آمیدیت شده بوسیله ترانس گلوتامیناز نوع 2(TG2) بعنوان اپی توپ های سلول های T در ارتباط با گلوتن ،محرک ضایعات التهابی مزمن روده ای هستند و باعث تحلیل ویلی ها و هایپرپلازی کریپت ها می شوند.

همانند CTD و AAV، روشهای سرولوژی مهمترین راه تشخیصی بیماری سیلیاک هستند که شامل تعیین آنتی بادی های خودایمن علیه اندومیزیوم (EmA) ، پپتیدهای گلیادین دی آمیدیت شده (DGP)، و ایزوتوپ های TG2 و IgA می باشد. در حقیقت، بدلیل عملکرد عالی متد IIF برای تشخیص EmA، این آنتی بادی خودایمن بخصوص هنوز بعنوان رفرانس استاندارد در بین آنتی بادی های خودایمن اختصاصی بیماری سیلیاک در نظر گرفته می شود. اما، مشابه آزمایش ANA و آنکا به روش IIF، آنالیز EmA به روش IIF بدلیل عواملی چون دخالت فردی ، تنوع ماده زمینه، و سختی اتوماسیون بیشتر و بیشتر زیر سوال رفته است. پس بطور واضح، آزمایش آنتی بادی خودایمن anti-TG2 بوسیله آزمون ایمونومتریک فاز جامد بجای روش IIF مورد توجه قرار گرفته است.

بطور خلاصه، بنظرمی رسد روش IIF بعنوان اولین تکنیک بکار گرفته شده برای آزمایش آنتی بادی های خودایمن در تشخیص انواع بیماریهای خودایمن علیرغم کاستی هایش همچنان در بین آزمایشگاهیان و متخصین بالینی بقوت خود باقی است. الحاق روش IIF بعنوان روش استاندارد و غربالگر برای آنالیز آنتی بادی های خودایمن به استراتژی دو مرحله ای یا چندگانه هنوزد  مورد نیاز است ولی هزینه های زیادی برای سیستم های بهداشتی که در حال حاضر با هزینه های زیادی مواجه هستند در بردارد.

 

 

تستهای تکی برای آنالیز آنتی بادی های خودایمن

معرفی رنگهای فلورسنت و پیشرفت متدهای ایمونوشیمی برای نشان گذاری کردن آنتی بادی ها از طرفی و میکروسکوپ های فلورسنت از طرف دیگر راه را برای روش IIF بعنوان ابزاری قوی در آنالیز آنتی بادی های خودایمن در دهه 1950 هموار نمود. بنابراین، تعیین ANA به روش IIF ابتدا روی بافت کبد موش و سپس روی سلولهای HEp-2 بعنوان ماده زمینه ای اتوآنتی ژنی شروع تعیین آنتی بادی های خودایمن در تشخیصهای سرولوژیکی CTD را رقم زد. اما، بزودی مشخص گردید که نیاز بالینی برای آنتی بادی های خودایمن اختصاصی-بیماری تنها بوسیله ANA بدرستی برطرف نشده است. جستجو برای آنتی بادی های خودایمن اختصاصی بیشتر منجر به معرفی تکنیکهای ایمونوفیوژن گردید که کشف آنتی بادی های خودایمن اختصاصی-بیماری همچون آنتی بادی خودایمن Sm در بیماران دچار SLE را به دنبال د اشت. بطور خاص، استفاده از عصاره تیموس با روش DRID  باعث رضایتمندی متخصصین بالینی از اختصاصیت بالای این عامل جدید برای تشخیص سرولوژی CTD گردید. آنتی بادی خودایمن علیه Sm بعنوان مارکر تشخیصی برای بیماری SLE همراه با ANA بکارگرفته شد و هنوز بعنوان یکی از اختصاصی ترین عوامل سرولوژیکی برای SLE درنظر گرفته می شود. اما، روش DRID یک تکنیک وقت گیر است و بنابراین بعدها با روش CIE که قادر به تعیین سریعتر و حساس تر آنتی بادی های خودایمن خاصی بود جایگزین گردید. چندین آنتی بادی خودایمن علیه کمپلکس اسپلیسئوزمال از جمله آنتی بادی های خودایمن علیه ریبونوکلئوپروتئین U1(U1-RNP) بعنوان مارکرهای جدید برای CTD کشف شدند. آنتی U1-RNP بعنوان مارکر سرولوژیکی اختصاصی برای تشخیص MCTD قرارگرفت و در بیماران دچار SLE نیز یافت شد. معرفی تکنیکهای آزمونی جدید مثل ایمونواسی های پرتویی (RIA) و آنزیمی در کنار روشهای radio/immunoprecipitation راه را برای پیشرفت آزمونهای تشخیصی آنتی بادی های خودایمن با عملکردهای بهتر هموار ساخت. بخصوص، پیشرفت در علم پروتئین شناسی و معرفی تکنیکهای ایمونوبلات، خالص سازی و شناسایی تارگتهای اتوآنتی ژنی بخصوصی را مقدور ساخت. مشخص گردید که Sm و U1-RNP از چندین جزء اتوآنتی ژنی خاص از جمله U1-RNA با خصوصیات متفاوتی جهت عملکردشان بعنوان اتوآنتی ژن جداکننده، بخصوص در فاز جامد الایزا تشکیل شده اند. علاوه براین اتوآنتی ژن های اختصاصی شوگرن شامل SS-A و SS-B کمپلکسی را تشکیل می دهند که با yRNA واکنش می دهد. قابل توجه است که این موضوع در مورد واحد 60 کیلودالتونی SS-A صدق می کند و واحد 52 کیلودالتونی SS-A (TRIM21) به yRNA متصل نمی شود و بنابر این در این کمپلکس snRNP دخالتی ندارد. این موضوع این سوال را مطرح نمود که بهترین ترکیب این تارگتها برای تعیین آنتی بادی های خودایمن مشخص چیست و یا کاربرد زیرمجموعه این تارگتها با بهترین عملکرد آزمون ها چه می باشد. در مورد U1-RNP که شامل اجزای A و C و یک پلی پپتید 68 کیلودالتونی می باشد، مشخص گردید که حداقل دو یا سه مورد از این اجزا برای آنتی ژن های فاز جامد باید بکار گرفته شوند تا یک الایزای مناسب برای تعیین آنتی بادی های خودایمن علیه U1-RNP طراحی گردد. در مقایسه، بنظر می رسد جزء SmD از کمپلکس Sm با 6 زیرمجموعه اش که قبلاً ذکر گردید، حساس ترین و اختصاصی ترین تارگت اتوآنتی ژنی در الایزا برای تشخیص سرولوژی SLE می باشد.

عموماً، معرفی آزمون های فاز جامد همچون الایزا با چهار جنبه اصلی تغییر درک تست های آنتی بادی های خودایمن همراه بود: (1) قابلیت استفاده بهتر بعنوان پلات فرم آزمون، (2) افزایش حساسیت در مقایسه با تکنیکهای ایمونودیفیوژن، (3) عملکرد متفاوت آزمون با آنتی بادی های خودایمنی که اپی توپ های کانفورماسیونی و غیر کانفورماسیونی و خطی را شناسایی می کنند ، و (4) معرفی سرمهای مرجع برای استاندارد سازی تشخیص ها. این یک قدم اساسی در جهت استاندارد سازی و اتوماسیون آزمایش های آنتی بادی های خود ایمن بود که تقاضای رو به رشد آن، به علت ورود آزمایش های آنتی بادی های خودایمن به معیارهای تشخیصی یا طبقه بندی بیشتر و بیشتر بیماری های خودایمنی، را جوابگو بود و محیط آزمایشگاههای خود ایمنی را بطور چشمگیری تغییر داد. به دنبال آن، آزمونهایی چون روش IIF که با دخالت فردی همراه هستند و تا همین اواخر اتوماسیون آن دشوار بود، با فشار زیادی برای جایگزینی مواجه شدند. در این راستا، چندین محقق تحت تاثیر مزایای تکنیک الایزا و بخصوص حساسیت بالاتر آن قرار گرفتند تا برای توسعه آزمونهایی که عصاره سلولی MOLT4 یا سلولهای HEp-2 را بکار می برند تلاش نمایند. علاوه براین، بالابودن حساسیت الایزای آنتی SS-A ، سرمهای منفی کاذب ANA در  بیماران دچار CTD را مشخص نمود. در حقیقت، بنظر می رسد این تنها تارگت اتو آنتی ژنی می باشد که حتی با سلولهای HEp-2 نیز بطور صحیحی ارائه نمی شود و باعث نتایج یافته های منفی کاذب ANA با استفاده از روش IIF می گردد.  به منظور غلبه بر این کاستی روش IIF ، سلولهای HEp-2 که بطور ژنتیکی دستکاری شده و بیان بیشتری از پلی پپتید 60 کیلودالتونی SS-A دارند برای آزمایش ANA معرفی شدند.

قابل توجه است که افزایش حساسیت الایزا منجر به یافتن آنتی بادی های خودایمن مثبت در افراد غیر بیمار گردید که باعث بحث های زیادی در راستای یافتن راه درست برای تعیین کات آف مناسب شد. در آخر، آنالیزهای منحنی های انجام گرفته برای روش های کمی مثل الایزا بعنوان بهترین مرجع مورد تایید قرارگرفت. بخشی از نتایج مثبت کاذب می تواند مربوط به آنتی بادی های خودایمنی باشد که قبل از شروع علائم بیماری بعنوان مارکرهای پیش گویی کننده ظاهر می شوند. با این وجود نتایج مثبت کاذب الایزا می تواند مربوط به آنتی بادی های خود ایمن علیه اپی توپ های غیر کانفورماسیونی (شاخص های شکلی) باشد که برای بیماری کمتر اختصاصی می باشد. این آنتی بادی های خودایمن اغلب متعلق به دسته آنتی بادی های خودایمن طبیعی می باشند و قدرت اتصال کمتری به تارگتهای مربوطه دارند. یک مثال واضح آنتی بادی خودایمن anti-dsDNA می باشد که بعنوان مارکری برای تشخیص SLE معرفی گردیده است. قابل ذکر است که اپی توپ dsDNA اختصاصی SLE به خوبی تعریف نشده است و روش IIF که روی dsDNA کینتوپلاست Crithidia luciliae انجام می گیرد (CLIFT)، به نظر می رسد اختصاصی ترین روش برای تشخیص این مارکر در بیماری SLE می باشد. جایگزینی CLIFT با اندازه گیری Farr RIA ،که قدرت اتصال بالایی برای آنتی بادی های خودایمن علیه dsDNA بدلیل محیط واکنشی نمکی روش الایزا برای اپی توپ های کانفورماسیونی و غیر کانفورماسیونی دارد، منجر به تعداد زیادی نتایج مثبت کاذب بخصوص در افراد دچار بیماری های عفونی گردید.

پدیده مشابهی نیز وقتی اتوآنتی ژن های نوترکیب یا سنتز شده برای آزمایش آنتی بادی های خودایمن به منظور غلبه بر مشکلات مربوط به تخلیص و استاندارد سازی آنتی ژن بکار گرفته شدند، مشاهده گردید.  این پلی پپتیدهای غیرطبیعی جایگزین تارگتهای اتوآنتی ژنی طبیعی ،البته نه در تمامی موارد، برای آنالیز مناسب آنتی بادی های خودایمن شدند. بنابراین پلی پپتید SmD ، وابسته به متیلاسیون قرینه ای آرژنین بود تا اپی توپ اختصاصی SLE را برای سنجش حساس آنتی بادی خودایمن anti-Sm ارائه دهد. علاوه براین، حضور yRNA برای اتوآنتی ژنیک بودن کمپلکس SS-A/SS-B از یک طرف و U1-RNA برای واحد Sm/RNP از طرف دیگر بطور واضحی برای آنالیز حساس آنتی بادی های خودایمن مربوطه لازم بودند.     

قابل ذکر است که آزمایش آنکا نیز مشکلات مشابهی را داشت. همانند آزمایش ANA ،روش IIF بعنوان اولین تکنیک آزمونی بر روی نوتروفیل های فیکس شده معرفی گردید. اما، تعیین PR3 و MPO بعنوان تارگتهای اصلی آنکا و آنالیز متعاقب آنتی بادی های خودایمن بوسیله الایزا به سبب حساسیت نامطلوب، آزمایش آنتی بادی های خودایمن علیه PR3 متوقف گردید. درحقیقت، حفظ ترکیب اپی توپ های کانفورماسیونی PR3 بر روی فاز جامد الایزا مشکل بود. اخیراً نسل سوم الایزای PR3-ANCA با استفاده از ملکولهای anchor-based در طول جذب PR3 به فاز جامد معرفی شدند که باعث حفظ شکل شان و قابل دسترس بودن اپی توپ های اختصاصی واسکولیت می گردد. سایر تلاشها برای افزایش حساسیت الایزای PR3-ANCA شامل استفاده از مخلوط PR3 های طبیعی و نوترکیب می باشد.

ارتباط نزدیک بین حساسیت و ویژگی، احتمالا دلیل این موضوع است که روش های direct-ligand RIAs با وجود حساسیت بسیار بالا، بطور وسیع برای آنالیز آنتی بادی های خودایمن اختصاصی AAV یا CTD بکار گرفته نشده اند. جالب توجه است که در موارد خودایمن اختصاصی اندام مثل دیابت نوع 1 (T1D)  روش RIAs  بخاطر حساسیت بالایش تاکنون مورد ستایش بوده است. روش IIF روی پانکراس اولین تکنیک بکار رفته برای آنالیز آنتی بادی های خودایمن قبل از معرفی اتوآنتی ژنهای مربوطه بوده است .    تعیین آنتی بادی های خودایمن islet-cell بوسیله روش IIF هنوز کاربرد دارد ؛اما، تاثیر اپی توپ های کانفورماسیونی برای آزمایش آنتی بادی های خودایمن T1D همراه با افزایش حساسیت روش RIAs و اخیراً روشهای الایزای نوپدید با عملکرد مشابه تقریباً باعث جایگزینی آنها با روش IIF شده است.

بعد از کشف TG2 بعنوان تارگت اتوآنتی ژنی EmA برای آزمایش بیماری سیلیاک، پیشرفت مشابهی در تشخیص سرولوژیکی CD مشاهده گردید. برای دستیابی به یک آزمون حساس برای آنتی بادی های خودایمن علیه TG2، اپی توپ های کانفورماسیونی TG2 بنظر می رسد اساسی باشند. اما در مقایسه با آزمایش آنتی بادی های خودایمن T1D، تعیین EmA بوسیله روش IIF هنوز بهترین روش می باشد.

درحقیقت، ویژگی بیشتر آنتی بادی های خودایمن بیماری به اپی توپ های کانفورماسیونی احتمالاً دلیل استفاده کمتر از آزمون های ایمونوبلات در سرولوژی آنتی بادی های خودایمن می باشد. بطور واضح، بدلیل ارائه ضعیف چنین اپی توپ هایی روی غشای بلات که ناشی از اثرات دناتوره کردن سدیم دودسیل سولفات در طول الکتروفورز است و استاندارد سازی ضعیف روش که ناشی از ویژگیهای فنی می باشد، تکنیک ایمونوبلات ارزش تشخیصی خود برای آزمایش آنتی بادی های خودایمن را از دست داده است. با این وجود، بدلیل پیشرفت در تعیین تعداد بیشتری از آنتی بادی های خودایمن در تشخیص، پیش بینی و پیش آگهی بیماریهای خودایمن، جستجو برای استراژی های مناسب تر برای آزمایش آنتی بادی های خودایمن در جهت رفع نیازهای بالینی ادامه دارد. بعنوان مثال، بیش از 100 آنتی بادی خودایمن به تنهایی در بیماران دچار SLE یافت گردید. این موضوع منجر به معرفی تجهیزات کاملاً اتوماتیک با بکارگیری فلورسنت و کمی لومینسانس برای آزمایش آنتی بادی های خودایمن و غربالگری گردید.   

قابل توجه است که توصیه های مجمع بین المللی، استراتژی دو مرحله ای برای آنالیز ANA و آنکا را پیشنهاد نموده است. بنابراین، روشIIF هنوز یک آزمایش غربالگری معتبر است که با ارزش پیش بینی کننده منفی بالا شناخته می شود. یافته های مثبت IIF باید توسط آزمونهای خاص آنتی بادی های خودایمن با استفاده از روشهایی با اختصاصیت بالا تایید گردند. برای چندین اختلال خودایمن از جمله بیماری سیلیاک، روش IIF  هنوز بعنوان مناسب ترین روش تشخیصی در نظر گرفته می شود. بنابراین، برخلاف معرفی آزمون های دیگر برای تعیین آنتی بادی های خودایمن اختصاصی، هنوز باید این آنتی بادی ها به روشهای گوناگون مورد بررسی قرارگیرند.  

 

آزمون های چندگانه برای آزمایش آنتی بادی های خودایمن

افزایش درخواست آزمایش برای اتوآنتی بادی های دخیل در سرولوژی یک بیماری خود ایمن باعث پیشرفت آزمون های چندگانه گردیده است. علیرغم این حقیقت که تعیین ANA با روش IIF با استفاده از سلولهای HEp-2 بعنوان ماده اتوآنتی ژنی زمینه، خود یک آزمایش چندگانه است که الگوهای مختلف برای آنتی بادی های خودایمن موجود در سرم مورد بررسی را نشان می دهد ولی آنالیز آنتی بادی خودایمن اختصاصی به سختی انجام می گردد. حتی برای الگوهای قابل تعیینی همچون سنترومر با بیش از 40 نقطه فلورسنتی پراکنده در هسته سلول های اینترفاز و متراکم در سلولهای متافاز، چندین پروتئین ممکن است بعنوان تارگت اتوآنتی ژنی بوسیله آنتی بادی های خودایمن شناسایی شوند (centromere-associated proteins A, B, and C).

همانطور که قبلا ذکر شد، ایمونوبلات اولین تلاش برای پایه گذاری یک آزمایش چندگانه مناسب برای تایید ANA هایی بود که با استفاده از عصاره کل سلول- چیزی مشابه خاصیت اتوآنتی ژنی سلولهای HEp-2 - تشخیص داده می شدند. اما، بدلیل چالش های تکنیکی، بازده کم، و از دست دادن ساختمان کانفورماسیونی طبیعی اپی توپ های اتوآنتی ژنی مربوطه، این روش بعنوان آنالیز استانداردی برای آنتی بادی های خودایمن در نظر گرفته نشد.

در نتیجه روشهای پیشرفته خالص سازی برای اتوآنتی ژن ها و بهبود ارائه تارگت های اتوآنتی ژنی نوترکیب، استفاده از منابع ملکولی نه تنها باعث پیشرفت الایزای singleplex برای آنتی بادی خودایمن گردید بلکه ایمونواسی های چندگانه خطی و نقطه ای (D/LIAs) نیز ایجاد شدند. در آزمایشگاههای روتین، روش D/LIAs بعنوان آزمایش استاندارد برای تایید ANA و آنکا بکار می رود. علاوه براین، بنظر میرسد D/LIAs یک راه حل عالی برای سایر تشخیصهای سرولوژیکی باشد. این موضوع نه تنها در مورد سرولوژی CD صدق می کند بلکه در مورد سرولوژی SSc، DM/PM و بیماری خودایمن کبد نیز کاربرد دارد. بنابراین، D/LIAs با بیش از 20 تارگت اتوآنتی ژنی برای تایید تشخیصی ANA با موفقیت معرفی گردید. قابل توجه است که با کوچک کردن تکنیک با استفاده از دستگاههای پیچیده نانو و ایجاد نرم افزاری برای تشخیص الگوها این روش موثرترین روش سنجش آنتی بادی های خودایمن چندگانه در آینده می باشد.

در اینجا باید ذکر نمود که تلاش برای بکارگیری پلات فرم های الایزای 96 چاهکی برای آنتی بادی های خودایمن با استفاده از چاهک های تکی برای آنتی ژن های مشخص، فقط  یک روش واسطه بود که خیلی زود بدلیل کاستی هایش زیر سوال رفت.

پیشرفت در خوانش های فلورسنتی و فلوسایتومتری و میکروسکوپی راه را برای دوره جدیدی در چندگانه سازی روش ها هموار نمود. بنابر این، چندین روش چندگانه با بکارگیری surface-activated microbeads که از یک طرف با رنگهای فلورسنت، اندازه و یا شکل نشان گذاری شدند و از طرفی بکارگیری میکروسکوپ های فلورسنت یا فلوسایتومتری بعنوان خوانش گرها گزارش شده است معرفی شد.

تکنولوژی جالب biochip mosaic باعث خوانش IIF چندگانه با استفاده از سلولهای گوناگون و مواد بافتی در فاز جامد گردید. علاوه براین، تکنولوژی لومینکس که میکرو بیدهای نشانگذاری شده با فلورسنت را بطور ردیفی قرار داده و روش فلوسایتومتری باعث پیشرفت یک تکنیک تعیین آنتی بادی های خودایمن بسیار موفق و جذاب گردید. خیلی زود، این تکنولوژی جدید توسط چندین کمپانی بصورت تجاری درآمد. امکان تعیین چندین آنتی بادی خودایمن و بازده زیاد این روش منجر به پیشرفت سیستمهای چندگانه ای همچون Athena و FIDIS یا سیستم تمام اتوماتیک BioPlex2000 با قابلیت تشخیص سرولوژیکی چندین بیماری خودایمن گردید. موفقیت روزافزون و اتوماسیون تکنیک لومینکس بخصوص برای آزمایشگاههای بزرگتر با حجم نمونه های زیاد  بسیار جذاب بود. درحقیقت، درخواست برای آزمایش آنتی بادی های خودایمن در دهه 1980 افزایش چشمگیری داشت و این مسئله حتی استراتژی توصیه شده دو تیتری روش IIF را بعنوان روش غربالگری ایده آل زیر سوال برد. در واقع آزمایشگاهها بخصوص در آمریکا شروع به جایگزینی روش IIF کردند که بدلیل کاستی های اساسی اش از جمله عدم قابلیت اتوماتیک شدن، استانداردسازی، پردازش داده های جدید، و نبود افراد با تجربه برای خوانش الگوهای IIF بود. اگرچه تکنیک پیشرفته جدید لومینکس برای سنجش آنتی بادی های خودایمن به کاهش فشار از نظر تجزیه و تحلیل این اتوآنتی بادی کمک نمود، باعث نارضایتی رو به رشد در بین متخصصین روماتولوژیست بخاطر عملکرد تکنیک گردید. متعاقباً، کالج آمریکائی روماتولوژی (ACR) در سال 2009 کاری گروهی را برای تحقیق در این زمینه آغاز کرد. در نتیجه، روش IIF بعنوان روش استاندارد برای خوانش ANA تایید گردید و آزمایشگاهها خواستار بازگشت به استراتژی دو مرحله ای شدند همچنین اطمینان حاصل کنند که متخصصین درخواست کننده آزمایش ANA عملکرد تست های مختلف چندگانه آگاهی دارند.

قابل توجه است که علیرغم پیشرفت آزمایشهای چندگانه مشابه برای آنکا، روش IIF همچنان به عنوان آزمایش غربالگری در استراتژی دو مرحله ای به چالش کشیده نشده است.

 

بهبود روش IIF با فلورسنت دیجیتالی

تصمیم برای کار گروهی ANA توسط ACR برای حفظ موقعیت روش IIF و تایید استراتژی دو مرحله ای برای سرولوژی CTD شدیداً نیازمند بازبینی تکنیک IIF بود.

برای بکارگیری این روش در آزمایشگاههای مدرن برای آزمایش آنتی بادی های مربوط به CTD ، کاستی های روش IIF که قبلاً ذکر گردید باید برطرف می شدند. در اینجا پیشرفت چشمگیر میکروسکوپی فلورسنت، عکس گرفتن، و نرم افزار پیشرفته به عصر جدیدی از فلورسنت دیجیتال کمک نمود. سیستم AKLIDES خوانش اتوماتیک IIF را بوسیله پروسه چندمرحله ی دنبال هم شامل گرفتن عکس بوسیله دوربین CCD و نرم افزار کنترل کیفیت، تقسیم، تفسیر و طبقه بندی هدف با استفاده از الگوریتم های شناسایی الگوی جدید امکان پذیر می کند. بنابراین، این سیستم که ترکیبی از مدل های سخت افزاری مختلف شامل میکروسکوپ موتوری فلورسنت اینورت می باشد، فوکوس دینامیک کمی را در دریافت سیگنال های فلورسنت ایجاد می کرد. به این ترتیب، افزایش استانداردسازی و اتوماسیون، اختلافات زیاد بین و داخل آزمایشگاهی روش IIF برای ANA را کاهش داد و تمایز رنگ آمیزی هسته از سیتوپلاسم را امکان پذیر ساخت و این روش را بعنوان غربالگری با دسترسی بیشتر و بازه بهتر ارائه نمود.

سایر کمپانی ها شروع به ساخت سیستم های مشابه و تکنولوژی های جدیدتری برای تفسیر الگوهای IIF اتوماتیک نمودند. عموماً، این سیستم های تجاری موجود براساس دریافت دیجیتالی سیگنال فلورسنت بوده و اغلب آنها آنالیز اتوماتیک تصاویر IIF با استفاده ار الگوریتم الگوهای تشخیصی   را انجام می دهند(AKLIDES®, Medipan, Dahlewitz/Berlin, Germany؛ Nova View®, Inova, San Diego, USA ؛ Zenit G Sight, A. Menarini Diagnostics, Grassina-Firenze, Italy ؛ Europattern®, Euroimmun, Lübeck, Germany). اما، فقط چند سیستم بین نتایج غربالگری منفی و مثبت تمایز می دهد (Helios, Aesku.Diagnostics, Wendelsheim, Germany ؛  Image Navigator, Immuno Concepts, Sacramento, USA ؛ Cytospot, Autoimmun Diagnostika, Straßberg, Germany). بطور خلاصه تمامی سیستم هایی که نیاز به تفسیر اتوماتیک و عملکرد مطلوب را جوابگو بودند حداقل در مورد ارزیابی کیفی ANA ، توسط مطالعات تطبیقی حاصل شدند.

سیستم تمام اتوماتیک تفسیر ®  AKLIDES اولین پلات فرمی بود که عملکرد ارزیابی آن در مطالعات بالینی موفق بود. اگرر و همکارانش در سال 2010 اولین ارزیابی بالینی را بوسیله مقایسه کاربرد تکنولوژی جدید برای تعیین ANA سرم 1222 نفر در یک آزمایشگاه روتین، هم در دانشگاه و هم در بخش خصوصی منتشر کردند. یک هماهنگی حدود 93.0% (924/859) ئ 90.6% (298/270) بین تفاسیر® AKLIDES و روش کلاسیک خوانش ANA به ترتیب در دانشگاه و آزمایشگاه خصوصی گزارش گردید. قابل توجه است که آنالیز تیتر آخر براساس خوانش کمی فلورسنت بر کاستی اصلی روش IIF غلبه نمود و آن را در سطح سایر تکنیکهای آزمایشی کمی در آزمایشگاههای روتین قرارداد. بنابراین، دامنه بکارگیری سیستمهای تفسیر جدید (AKLIDES®, Europattern®, NovaView) با افزودن آزمایش آنتی بادی های خودایمن علیه آنکا و dsDNA به ترتیب روی نوتروفیل های انسانی و Crithidia luciliae افزایش یافت.

بطور خلاصه، پیشرفت چشمگیر این سیستم های اتوماتیک جدید تفسیرIIF جایگاه IIF را بعنوان تکنیک غربالگری با استراتژی دو تیتری برای آنالیز ANA و آنکا محکم نمود. بنابراین، حتی نیاز آزمایشگاههای بزرگ در رابطه با آزمایش اتوماتیک آنتی بادی های خودایمن بوسیله روش IIF با مدیریت آمار مدرن به اندازه کافی برطرف گردید. توزولی و همکارانش نتیجه گرفتند که دوره جدید تکنولوژیکی در آزمایشگاههای روتین خودایمنی بوسیله معرفی روش IIF تمام اتوماتیک در سال 2009 بوجود آمد. علاوه براین، این تکنولوژی ممکن است منجر به تحقیقات بالینی بر روی جمعیت بزرگتر بعنوان مثال شیوع الگوی (dense-fine speckled (DFS گردد و بنابراین آنتی بادی خودایمن علیه DFS70 در افراد مختلف بظاهر سالم و جمعیت بیمار بررسی شود.

 

ترکیب آزمایشات غربالگری  و تائیدی

با وجود پیشرفت فوق العاده در آزمایش اتوماتیک آنتی بادی های خودایمن بوسیله IIF در ابتدای این قرن، ضرورت بکارگیری دو تکنیک مختلف ازمایش برای استراتژی های دو مرحله ای آنالیز ANA و آنکا هنوز منتفی نشده است. این استراتژی باعث کنترل قابل قبول نتایج بدست آمده می گردد، زیرا آزمایش اختصاصی آنتی بادی های خودایمن ممکن نتایج مثبت کاذب در بر داشته باشد. برای نمونه، یک نتیجه الایزای مثبت anti-dsDNA همراه با ANA منفی نمی تواند برای تشخیص SLE در نظر گرفته شود. اگرچه، امکان نتایج منفی کاذب با استفاده از استراتژی دو تیتری بخصوص برای ANA در رابطه با سرم های مثبت برای اتوآنتی بادی های علیه SS antigen A(SS-A/Ro) هنوز وجود دارد و نشان دهنده یک اشکال اساسی این رویکرد می باشد. فقط  ترکیب دو مرحله در یک آزمایش چندگانه بر این کاستی ها غلبه می کند و یک راه حل ایده آل برای آزمایش آنتی بادی های خودایمن  مورد نیاز آزمایشگاهی و بالینی را ارائه می دهد. در حقیقت، این ایده جالب بسیار ساده است و بنابراین بنظر عجیب میرسد که هیچ تلاشی زودتر از این صورت نگرفته است. از این رو، ترکیبی از مزایای آزمون cell-based و پتانسیل آن برای ترکیب شدن با بوسیله ایمونواسی میکروبید (MIA) با بکارگیری IIF در یک محیط واکنش، می تواند انقلابی در تشخیص های بیماری های خودایمن ایجاد نماید (عکس 2).  

نسل دوم آزمایش ANA

برای درک ایده ترکیب تست غربالگری و تست تائیدی آنتی بادی های خودایمن، ما شروع به ایجاد یک محیط واکنشی منحصر به فرد IIF شامل آنالیز کلاسیک ANA روی سلولهای HEp-2 و تعیین چندگانه همزمان آنتی بادی های خودایمن با MIA نمودیم. در واقع، ادغام آزمایش غربالگری و تائیدی برای آنتی بادی های خودایمن خاص یک بیماری توانست مزایای زیادی را از جمله زمان کوتاه تر، تکرارپذیری بیشتر نتایج آنتی بادی های خودایمن، و بودجه مناسب تر، به خصوص برای تعداد نمونه های بیشتر ایجاد نماید.

ابتدا، روش MIA که جمعیت چندگانه ای از  carboxylated polymethylmethacrylate beadکه از نظر اندازه و غلظت رنگ فلورسنت متفاوت بودند برای چندگانه کردن آزمایش استفاده گردید. طبقه بندی جمعیت بیدها و اندازه گیری شدت فلورسنت لیگاندهای مربوطه توسط سیستم AKLIDES که قادر به تعیین 6 آنتی بادی خودایمن ضد هسته ای به Scl-70، Sm، SS-A(Ro60)، SS-B(La)، CENP-B و dsDNA بود خوانده شد. این آزمون ،اساس طراحی محیط واکنش منحصر بفرد IIF که می توانست با آزمایش کلاسیک ANA برروی سلولهای HEp-2 در یک آزمایش ادغام گردد را خلق نمود. تکنیک جدید تلفیقی آزمایش کلاسیک ANA با آنالیز تائیدی بوسیله MIA بنام تکنولوژیCytoBead®  نامگذاری گردید (عکس 3-a). گزینه های جدید فلورسنت دیجیتالی که قادر به آنالیز کمی بود نه تنها برای آزمایش آنتی بادی های خودایمن با روش MIA بلکه برای خوانش کلاسیک ANA روی سلولهای HEp-2  می تواند به راحتی با استفاده از CytoBead®  انجام پذیرد. بنابراین، می توانند بوسیله سیستمهای تفسیر کالیبره شده برای آزمایش اتوماتیک آنتی بادی خودایمن استاندارد گردند. در نتیجه، این یک دوره جدید استانداردسازی آزمایش ANA بطور کلی می باشد که در گذشته با آزمایش کلاسیک ANA به روش IIF امکان پذیر نبود.

 

Fig.3

CytoBead® assays for the detection of a antinuclear antibodies (ANA) with CytoBead® ANA assay, b antineutrophil cytoplasmic autoantibodies (ANCA) with CytoBead® ANCA assay, and c celiac disease (CD)-specific (auto)antibodies (auto/Abs) with CytoBead® CeliAK assay. Matching principle of specific fluorescence patterns on HEp-2 cells (a), neutrophil granulocytes (b), and esophagus tissue (c) with positive reactions of antigen-coated microbeads immobilized in peripheral compartments. CENP centromere protein, Da Dalton, dsDNA double-stranded DNA, EmA endomysial antibody, GBM glomerular basement membrane, MPO myeloperoxidase, PR3 proteinase 3, RNP ribonuclear protein, Scl-70 DNA-Topoisomerase I, Sm Smith, SS Sjögren-Syndrome, (+) positive, (−) negative

 

نسل جدیدی از آزمایش های آنتی بادی های خودایمن می تواند بوجود آید که نیاز آزمایشگاههای مدرن روتین برای تشخیص SARD/CTD را همراه با برطرف نمودن ایرادهای آزمایش دو مرحله ای حاضر اتوآنتی بادی ها را برطرف سازد.

اخیراً، این آزمون جدید که از آن به عنوان آزمایش نسل دوم ANA یاد می شود در یک تحقیق جامع سرولوژیکی که شامل موارد زیر بود ارزیابی گردید: 174 بیمار دچار SLE، 103 بیمار دچار SSc، 46 بیمار دچار SjS، 36 بیمار دچار RA، 13 بیمار دچار MCTD، 21 بیمار دچار DM/PM، 21 بیمار دچار بیماریهای عفونی، 93 بیمار دچار بیماری خودایمن کبد، 78 بیمار دچار بیماری التهابی روده، و 101 فرد سالم اهدا کننده خون. سیستم CytoBead برای ANA، بطور همزمان ANA را بر روی سلولهای HEp-2  و آنتی بادی های خودایمن علیه dsDNA، CENP-B، SS-A/Ro52، SS-A/Ro60،  SS-B/La،  RNP-Sm، Sm،  و Scl-70 را تعیین می نماید. هماهنگی خوب تعیین ANA بوسیله سیستم CytoBead و تعیین آن با روش کلاسیک IIF و الایزا، این نکته را تائید میکند که محیط واکنش ترکیبی جدید IIF برای یک مرحله از آنالیز ANA با استفاده از سلولهای HEp-2 و بیدهای فلورسنت پوشیده شده با اتوآنتی ژن بعنوان تارگت های مربوطه حداقل قادر به تامین عملکرد مشابهی همچون آزمایش کلاسیک دو تیتری ANA می باشند.

علاوه براین، تعیین همزمان ANA و آنتی بادی های خودایمن خاص همچون anti-SS-A/Ro بوسیله CytoBead ANA  تقریباً میتواند ریسک ایجاد جوابهای منفی کاذب را حذف نماید و مقادیر پیش بینی شده منفی واقعی تست ANA را افزایش دهد. قابل ذکر است که این موضوع خصوصاً مورد توجه روماتولوژیست ها می باشد که مایل به کنارگذاشتن وجود بیماری خودایمنی در تشخیص های افتراقی SARD بوسیله آزمایش ANA هستند. در این تحقیق، 267/4 (1.5%) بیماران ANA منفی با anti-SS-A یا anti-CENP-B مثبت توسط نسل دوم آنالیز ANA شناسایی شدند. در حقیقت، این بیماران خاص دچار RA و SjS توسط استراتژی دو تیتری توصیه شده حاضر نادیده گرفته می شدند.

 

نسل جدید آزمایش آنکا

تکنولوژی CytoBead برای آنالیز آنکا نیز بکار گرفته شد و نتایج CytoBead® ANCA در رابطه با عملکرد آزمون ارزیابی شد. در حقیقت، ترکیب هر دو روش IIF و آزمون آنتی ژن-اختصاصی در چندین تحقیق بعنوان استراتژی ایده آل برای تعیین آنکا عنوان شده و منجر به توصیه آزمایش دو مرحله ای آنکا گردیده است.

مشابه پیشرفت CytoBead® ANA ، بعد از طراحی یک آزمون چندگانه MIA برای تعیین MPO-ANCA ، PR3-ANCA و آنتی بادی های خودایمن علیه ناحیه غیر کلاژنی زیرواحد آلفا-3 کلاژن IV که آنتی ژن غشای پایه گلومرول (GBM) را ارائه می دهند، یک محیط واکنشی واحد برای تعیین آنکا روی نوتروفیل های فیکس شده بوجود آمد (عکس3). روش جدید CytoBead® ANCA یک ترکیب منحصر بفرد از روش کلاسیک cell-based با تکنولوژی چندگانه میکروبید می باشد.

سوآ و همکارانش 592 بیمار شامل 118 بیمار دچار AAV، 113 بیمار دچار RA،  49 بیمار دچار بیماریهای عفونی، 77 بیمار دچار بیماری التهابی روده، 20 بیمار دچار بیماری خودایمن کبد، 70 بیمار دچار کلانژیت اسکلروزان اولیه (PSC) ، و 125 فرد سالم اهدا کننده خون را انتخاب نمودند و آزمایش چندگانه  CytoBead® ANCA را در آنها با روش های کلاسیک از جمله IIF و الایزا مقایسه نمودند. آنالیز کمی آنکای MPO وPR3 بوسیله تکنولوژی چندگانه CytoBead®  بنظر برابر یا حتی بهتر از نتایج آزمایش الایزا برای آنکاهای خاص بود. جالب توجه است که آنالیز اتوماتیک تیتر نهایی آنکا تنها با یک رقت سرم بکار رفته در سیستم اتوماتیک تفسیری AKLIDES®  ،هماهنگی خوبی را با روش کلاسیک IIF روی نوتروفیل ها برای آنکا نشان داد. یافته جالب دیگر تعیین آنکای PR3 در بیماران دچار کولیت اولسراتیو (UC) و PSC بود که با کسانیکه دچار GPA بودند متفاوت بود. این آمار به نظر می رسد گزارش اخیر از بیماران PR3-ANCA مثبت مبتلا به UC و PSC تعیین شده توسط یکی دیگر از روش های حساس MIA تائید نمود. بنابراین، محیط واکنشی جدید CytoBead® ANCA آزمایش بسیار حساس آنکای PR3 را مقدور ساخت و ممکن است با نسل سوم الایزا از لحاظ عملکرد آزمایش رقابت کند.

بدنبال آن، ترکیب آزمایش اتوماتیک چندگانه غربالگری و تائیدیه آنکا به روش IIF در یک آزمون ممکن است جایگزین آزمایش دو مرحله ای وقت گیر حاضر آنکا با آنالیز یک مرحله ایCytoBead®  گردد. در تشخیصهای اورژانسی لازم برای گلومرولونفریت پیشرونده، آنالیز آنکا بوسیله CytoBead®  بنظر دستیابی جذابی برای برطرف نمودن نیاز متخصصین در تفسیر سریع آزمایش آنکا می باشد.

 

سرولوژی جامع CD

تشخیص سرولوژیکی CD شامل تعیین ایزوتوپ IgA EMA و آنتی بادی های خودایمن علیه گلیادین دی آمیدیت شده و TG2 می باشد. درواقع، EMA تعیین شده با روش IIF هنوز بعنوان استاندارد ایده آل برای آزمایش آنتی بادی های خودایمن در بیماری CD می باشد. برای برطرف نمودن نیاز به آزمایش جامع اتوآنتی بادی های اختصاصی CD از نظر حجم کاری و کاهش هزینه ها در آزمایشگاه های روتین خودایمنی، ما روش چندگانه آزمون CytoBead® CeliAK  را ایجاد نمودیم (عکس.3c). چنین روشی ممکن است حتی ابزار تشخیصی جالبی برای مولفه های جدید تشخیص بیماری که اخیراً بوسیله جامعه اروپایی گوارشی، هپاتولوژی و تغذیه اطفال (ESPGHAN ) ارائه شده است باشد. این مشخصه ها بطور واضح نقش سرولوژی CD را در تشخیص بیماران مشکوک به این بیماری قوت بخشید. بنابراین، CD می تواند بدون آزمایش های بافت شناسی از طریق بیوبسی های دئودنوم ، در مواردی که سطح اتو آنتی بادی IgA anti-Tg2 ده مرتبه بیشتر از میزان نرمال است، در بیماران مثبت برای HLA-DQ2  و یا HLA-DQ8  و در کسانی که پاسخ خوبی به رژیم عاری از گلوتن دارند یا آزمایش EmA آنها تایید می شود، تشخیص داده شود.

بنابراین روش جدید CytoBead® CeliAK توسط تحقیق بر روی 380 بیمار و کنترل شامل 155 بیمار دچارCD، 5 بیمار دچار کمبود IgA، 68 بیمار دچار سیتیک فیبروزیس، 59 بیمار دچار بیماری های چشم، و 93 فرد دهنده خون ارزیابی گردید. نتایج با روش کلاسیک آنالیز آنتی بادی خودایمن علیه IgA توسط روش الایزا و IIF مقایسه شدند. در حقیقت، تفاوت بین روش CytoBead®  و روش کلاسیک تنها برای آنتی بادی خودایمن anti-TG2 وجود داشت بطوریکه 8 سرم متناقض برای anti-TG2 با الایزا مثبت و باCytoBead® CeliAK  منفی شدند متعلق به چهار بیمار و چهار کنترل بودند. بطور کلی، روش CytoBead® CeliAK  اولین آزمون چندگانه کمی اتوآنتی بادی IgA علیه TG2 و anti-DG Ab است که آنالیز همزمان EmA به عنوان روش مرجع و آزمایش کمبود IgA را فراهم می کند. این دستیابی جامع موجب بهبود سرولوژی CD شده و نتایج عالی در رابطه با تعداد زیادی از بیماران دچار CD با سطوح اتوآنتی بادی anti-TG2 تا ده برابر میزان نرمال را به دلیل حساسیت بالایش ارائه می دهد. علاوه بر این به دلیل انعطاف پذیری تکنیک، اتوآنتی بادی های بیشتری از جمله آنتی بادی علیه GP2 را نیز ممکن است شامل گردد.

 

نتیجه گیری:

تا این زمان، تاریخچه آزمایشات آنتی بادی های خودایمن بوسیله پیشرفت های جالب چندین روش آزمونی مشخص گردیده است تا  پیشرفت فوق العاده ای در درک بیماری های خودایمن و تشخیص مناسب آنها صورت گیرد. امروزه بررسی آنتی بادی های خودایمن یک بخش کامل در تشخیص سرولوژیکی بیماری های SARD همچون CTD و AAV و اختلالات خودایمن وابسته به عضو می باشد. بنابر این، هیچ شکی در این مورد وجود ندارد که معرفی و تکامل بیشتر روش IIF بعنوان اولین تکنیک تشخیصی آنتی بادیهای خود ایمن اثر اساسی روی این روند داشته و دارد. در تاریخچه آزمایش آنتی بادی های خود ایمن ، تکنیک های مختلفی با روش های جدیدتر عملکرد آزمونی بهتر ظهور نموده است. مزایایی چون بازده بیشتر و استانداردسازی بهتر جایگزین گردیدند. در این زمینه، لازم است که توجه داشته باشید که روش IIF همچنان یکی از تکنیکهای کلیدی برای آنالیز آنتی بادی های خود ایمن محسوب می شود و حتی بعنوان آزمون غربالگری با استراتژی دو مرحله ای برای آزمایش ANA و آنکا توصیه می شود. علاوه بر این، در واقع روش IIF یک روش مرجع برای تعیین آنتی بادی های خودایمن خاص نظیر EmA در سرولوژی اختلالات خود ایمن وابسته به عضو محسوب می گردد .

علیرغم مزایای مشهود روش IIF، این تکنیک از ابتدا بعنوان یک روش وقت گیر، ارزیابی با مداخله انسانی، عدم اتوماسیون کامل و استاندارد سازی ضعیف مشخص گردیده است. خصوصاً، خوانش الگوها در آزمایشات ANA و آنکا مستعد ناهماهنگی در توصیف و طبقه بندی الگوی رنگ آمیزی مربوطه است.

بدنبال آن، روشهای آزمونی جدید با اساس ایمونواسی فاز جامد همچون الایزا یا تکنولوژی های چندگانه تکامل یافته و به آزمایشگاههای تشخیص خود ایمنی روتین معرفی شدند. با این وجود، بکارگیری روش IIF هنوز بعنوان روش استاندارد طلایی برای آزمایش های ANA، حتی با آخرین تکنولوژی های چندگانه، در مرحله آنالیز اتوآنتی بادی ها، توصیه می گردد.

این موقعیت بطور خارق العاده ای بوسیله پیشرفت فلورسنت دیجیتالی و اجرای آن در آزمایش های IIF تغییر نمود. راههای جدید تشخیص الگوها همراه با پیشرفت در میکروسکوپ فلورسنت اتوماتیک راه را برای تکامل یک نسل کاملاً جدید از سیستم های تفسیر خودکار هموار ساخت. پلات فرم های مختلف در دسترس روش IIF برای سنجش اتوآنتی بادی ها خصوصاً برای خوانش ANA و آنکا طراحی و بکار گرفته شدند. اولین مطالعات ارزیابی، عملکرد خوب این سیستم ها و هماهنگی زیاد بین تفاسیر چشمی و اتوماتیک آنتی بادی های خودایمن را پشتیبانی نمود.    m60ادی های خودایمن علیه ی، 93 بیمار دچار بیماری خودایمن کبد، 78 بیمار دچار بیماری التهابی روده، و 101 دهنده خون.

قابل توجه است که این پیشرفت تکنولوژی بزرگ شامل اکتساب تصاویر دیجیتالی فلورسنت و تشخیص اتوماتیک الگوها می تواند به سایر آزمونهای سلولی IIF در جستجو برای بیو مارکرهای جدید منجر گردد. بنابراین، مقدارسنجی γH2AX foci برای آنالیزآسیب DNA ،که قبلاً بسیار وقت گیر و وابسته به شخص بود و برای غربالگری هایی با تعداد زیاد مناسب نبود، می تواند استاندارد و اتوماتیک گردد. تحقیقات موفقیت آمیز ارزیابی، این مارکر آسیب DNA جدید را برای تشخیص فرم های پیشرونده مقاوم به داروهای سیتواستاتیک به حیطه بالینی معرفی نمود.

با این حال، از آنجایی که تعداد زیادی از آزمایشگاههای بالینی ایمونولوژی استراتژی دو مرحله ای را برای آزمایش ANA و آنکا بکار می برند، محدودیت های قابل توجهی در مورد بهره وری بالا و هزینه آن باقی می ماند. گسترش سیستم های تفسیر اتوماتیک IIF همچون ®  AKLIDES، پلت فرم منحصر بفردی را ایجاد نموده که ارزیابی کاملاً اتوماتیکی از آزمایشات غربالگری برپایه سلول و آزمونهای چندگانه آنتی ژن-آختصاصی را در یک محیط واکنش برای اولین بار امکان پذیر می سازد. تکامل تکنولوژی®  CytoBead با تلفیق غربالگری کیفی آنتی بادی خود ایمن و تست تاییدی در یک آزمایش IIF تعیین اتوآنتی بادی های نسل دوم را در یک تست امکان پذیر می سازد. این محیط واکنش چندگانه جالب نیازهای کلیدی برای یک آزمایش استاندارد موثر آنتی بادی های خودایمن در آزمایشگاههای روتین را برطرف می سازد. معایب اصلی آنالیز کلاسیک آنتی بادی های خود ایمن بوسیله روش IIF توسط این روش جدید رفع گردید. اولین کاربرد تشخیصی برای آزمایش های نسل دوم ANA و آنکا به همراه سرولوژی جامع آنتی بادی (خودایمن) اختصاصی CD انجام پذیرفت و با موفقیت ارزیابی گردید.