مقدمه

گروه مطالعه BILULU شامل 7 میکروبیولوژیست آزمایشگاههای بیمارستانی است که در Flanders(Belgium) واقع می باشند. هدف اصلی این گروه استاندارد سازی مراحل تشخیص میکروبی بر اساس شواهد و اساس علم میکروب شناسی و نظرات کارشناسان است. شواهد علمی دستورالعمل آزمایش های ادراری فعلی ناقص است و برخی نکات در آن به خوبی روشن نشده است. هدف این پروژه رفع ابهامات از جز به جز این دستورالعمل است.

عفونتهای دستگاه ادراری (UTI) در طول زندگی افراد بسیار شایع است و هم در افراد سالم و هم افرادی که دارای سیستم ایمنی ضعیف تری هستند مشاهده می شود. UTI بیشتر در زنان شایع است و احتمال ابتلا به آن در طول زندگی فرد 50% است. تشخیص عفونت ادراری بر اساس علایم و نشانه های بیمار و با کمک شواهد آزمایشگاهی مانند وجود گلبولهای سفید و باکتری در ادرار انجام می گیرد. تشخیص آزمایشگاهی به وسیله شمارش گلبولهای سفید، آزمایش نواری (dipstick) و کشت ادرار صورت می گیرد. کشت ادرار یک بخش پرکار در بخش میکروب شناسی آزمایشگاه است. دستورالعمل های واضح برای تفسیر کشت های ادرار توسط تکنسین های آزمایشگاهی برای دستیابی به نتایج استاندارد، قابل اطمینان و مفید بالینی ضروری است. نتایج این مقاله به دو صورت به دست آمده است: توسط سرچ در اینترنت و مقالات مرتبط و نیز به وسیله مطالعه و ارزیابی روش های روتین.

 

مرحله پیش از آزمایش: جمع آوری نمونه، انتقال و رسیدگی به آن

جمع آوری نمونه

در بزرگسالان اغلب نمونه های ادرار جمع آوری شده برای آزمایش بوسیله تکنیک نمونه گیری از وسط نمونه ادرار صورت می گیرد. این تکنیک در همه جا بسیار مورد قبول قرار گرفته است زیرا ساده، ارزان و غیر تهاجمی است و ریسک عوارض جانبی ندارد. شمارش کلونی های نمونه های ادراری جمع آوری شده به وسیله این روش منطقی است و با نمونه هایی که به وسیله آسپیراسیون supra-pubic و یا کاتتر مستقیم گرفته شده اند مطابقت دارد. یکی از معایب این روش این است که نمونه ادرار ممکن است هنگام خروج از مجرای ادرار توسط باکتری های فلور طبیعی آلوده شود. یک راه ساده برای کاهش این مشکل، تمیز کردن پوست ناحیه تناسلی از آلودگی، مو و ترشحات است. همچنین جمع آوری نمونه به این روش از کودکان، سالمندان و افراد ناتوان دشوار است.

آسپیراسیون supra-pubic بهترین روش برای جلوگیری از آلودگی نمونه های ادراری در کودکان کم سن است ولی این روش کمتر کاربرد دارد زیرا تهاجمی، دشوار و زمان بر است. جمع آوری نمونه ادرار به وسیله کاتتر روش دیگر جمع آوری نمونه ادرار است که میزان آلودگی نمونه را کاهش می دهد. اگرچه این روش به چندین دلیل کاربرد محدودی دارد: این روش دشوار، پر هزینه و تهاجمی است و با وارد کردن کاتتر در مثانه احتمال انتقال باکتری ها  و عفونت مثانه وجود دارد. از آنجایی که پروسه کشت ادرار به نوع نمونه گرفته شده بستگی دارد، ضروری است که روش جمع آوری نمونه در فرم درخواست آزمایشگاه ذکر شود. نکته ضروری دیگر تاریخ و زمان جمع آوری نمونه است و همچنین هر نکته کلینیکی مانند درمان آنتی باکتریایی، شرایط ایجاد کننده عفونت ادراری مانند اختلالات آناتومیکی، سنگ یا وجود مواد خارجی) باید مشخص شود.(جدول 1)

 

 انتقال و ذخیره نمونه ها

مطالعات بسیاری اثر منفی تاخیر در انتقال و انجام تست های ادراری را بر روی نتایج آزمایشگاهی نشان داده اند. در این مطالعات افزایش تعداد واحد تشکیل کلونی (CFU) بر ml بیش از 105< CFU/ml برای این نمونه ها مشاهده شد که موجب نتایج مثبت کاذب می شود. بنابر این در دستور العمل های فعلی توصیه می شود که نمونه ها ظرف دو ساعت از نمونه گیری مورد آزما یش قرار گیرند. (جدول1). اگر نمونه ادرار در این مدت 2 ساعته به آزمایشگاه نرسد نمونه ها می توانند تا 24 ساعت در 8-2 درجه ذخیره شوند. راه دیگر هم جمع آوری نمونه ها در ظروف حاوی ماده نگه دارنده است مانند اسسید بوریک-گلیسرول و یا اسید بوریک سدیم.

 

قابلیت تکرار پذیری نمونه ادرار

گاهی بیش از یک نمونه ادرار برای تشخیص عفونت ادراری لازم است. به عنوان مثال در موارد آلودگی مجرای ادرار که منجر به مثبت کاذب می شود و موارد منفی کاذب در مورد مصرف زیاد مایعات. پس از شروع درمان ضد میکروبی باکتری ها پس از 48 ساعت از ادرار حذف می شوند. برای اثبات ریشه کن شدن باکتری ها کشت ادرار توصیه نمی شود مگر در مورد نقص در انجام درمان.

 

تشخیص احتمالی UTI (عفونت های ادراری)

آزمایش نواری ادرار (تشخیص نیترات ردوکتاز و لکوسیت استراز)، شمارش سلولها (به وسیله میکروسکوپ، فلوسیتومتر و یا تکنیک های تشخیص عکس) و میکروسکوپی نمونه های رنگ آمیزی گرم، تکنیک های مهمی برای تشخیص احتمال UTI هستند. در هر دو نوع مطالعه گذشته نگر و آینده نگر نشان داده شده است که آزمایش های نواری به میزان لازم برای تشخیص عفونت های ادراری حساس نیستند. علت حساسیت کم تست های نواری و نتایج منفی کاذب آنها عبارتند از: مدت زمان کم ماندن ادرار در مثانه که برای تبدیل نیترات به نیتریت کافی نیست، دفع ادراری کم نیترات، عدم توانایی برخی از ارگانیسم ها برای تبدیل نیترات به نیتریت( مانند Enterococcus faecalis ) و کاهش pH ادرار( در موارد نوشیدن برخی نوشیدنی ها مانند کورن بری و یا رژیم های غذایی خاص). مقالات مختلف نتایج متفاوتی را برای تشخیص باکتری در ادرار به وسیله فلوسیتومتری گزارش نموده اند. بر حسب نوع نمونه حساسیت و ویژگی از 74 تا 100 درصد و 41.9 تا 98.2 متفاوت است. رنگ آمیزی گرم نمونه های ادراری نیز می تواند به عنوان تکنیکی برای غربالگری عفونت ادراری استفاده شود. ولی این کار دشوار و مستلزم تجربه کافی است. حساسیت تکنیک بستگی به این دارد که آیا نمونه سانتریفوژ شده یا خیر. در نتیجه ما روش نواری، فلوسیتومتری و یا رنگامیزی گرم را بعنوان معیاری برای کشت و تشخیص عفونت ادراری توصیه نمی کنیم. یک مرور کلی از توصیه های قبل از بررسی آزمایشگاهی برای تشخیص میکروبیولوژی UTI درجدول 1 ارائه شده است.

 

 بررسی نمونه

کشت نمونه  ها تعداد CFU/ml را مشخص می کند و جداسازی کلونی های باکتری را برای شناسایی و تست تعیین حساسیت فراهم می کند. کشت نمونه های غیر تهاجمی باید تشخیص 104 یا 105 CFU/ml را موجب شود. این تشخیص معمولاً به وسیله استفاده از 1 میکرولیتر از ادرار بر روی محیط کشت مناسب مشخص می شود. برای نمونه های تهاجمی تر( مانند آسپیراسیون supra-pubic) و یا برای کشت مخمرها، 10 میکرولیتر از ادرار باید بر روی محیط کشت مناسب تلقیح شود تا به حداقل تشخیص 102 CFU/ml برسد. استفاده از مقادیر بیشتر از 1 میکرولیتر نمونه برای کشت می تواند موجب رشد بیشتر شده و نتایج را تغییر دهد.

نمونه های ادرار را می توان به روش های مختلف بر روی محیط کشت تلقیح کرد. به غیر از موارد استفاده از پیپت های کالیبره شده در سایر موارد استفاده از شمارش کلونی تقریبی است و تا بیشتر از 100 برابر می تواند خارج از رنج باشد. خصوصاً در تعداد بالاتر یک کلونی نشان دهنده 1 CFU نیست و کشت ادرار دقت لازم را ندارد. به همین جهت برای نتایج مطمئن تر استفاده از لوپهای استریل، کالیبره شده یا اتوماتیک برای مقادیر 1 و 10 میکرولیتر برای تلقیح نمونه های ادرار توصیه می شود. علاوه بر محیط کشت MacConkey agar ، تعداد زیادی از محیهای رنگزای انتخابی برای شناسایی و تمایز پاتوژن های ادراری وجود دارد. این محیط های ادراری می توانند برای همه نمونه های ادراری یا آنهایی که ریسک آلودگی بیشتری دارند (مانند نمونه های گرفته شده به وسیله کیسه ادراری) استفاده شوند.

ارگانیسم های خاص کلونی های رنگی ایجاد می کنند که بسته به آنزیم هایی دارد که تولید می کنند و واکنش آنها با مواد موجود در محیط کشت. این محیط ها شناسایی اکثر پاتوژن های ایجاد کننده عفونت ادراری شامل Enterobacteriaceae و Enterocococci را امکان پذیر می کنند. علاوه بر محیط های MacConkey agar و رنگ زا، محیط Blood agar برای شناسایی باکتری های گرم مثبت و مشکل پسند بکار می رود. همچنین محیط کشت های colistin-nalidixic acid (CNA) آگار یا Phenylethyl alcohol agar برای شناسایی باکتری های گرم مثبت و مهار رشد و swarming باکتری پروتئوس، بکار می روند.

برای نمونه های ادراری گرفته شده از بیماران سر پایی تلقیح روتین بر روی محیط های کشت انتخابی برای باکتری های گرم مثبت لازم نیست چون اکثر عفونت های ادراری ایجاد شده در بیماران سر پایی به وسیله باکتری های گرم منفی هوازی ایجاد می شوند. حتی در جمعیت های بیمار که در آن Staphylococcus saphrophyticus یک علت شایع UTI است، استفاده از محیط کشت های انتخابی لازم نیست. نمونه های ادراری که از بیماران بستری در بیمارستان گرفته می شوند اغلب آلوده به Enterococci هستند. از آنجایی که پاتوژن های قارچی به خوبی در محیط blood agar رشد می کنند بنابر این لزومی ندارد که از محیط های انتخابی قارچ برای کشت ادرار استفاده کرد. در مواردی که احتمال بالای عفونت ادراری در اثر عوامل قارچی و مخمرها وجود دارد، در صورت درخواست پزشک، از یک محیط قارچی اضافی (sabouraud  یا chromagar ) نیز استفاده می شود.

در مواردی که احتمال می رود باکتری های مشکل پسند مانند Actinotignum schaalii عامل عفونت ادراری باشد پیشنهاد می شود که از بلاد آگار در ترکیب با یک محیط کشت انتخابی مانند MacConkey یا محیط های رنگ زای کشت ادرار، بدون توجه به نوع نمونه و جمعیت مورد آزمایش، استفاده شود.

تمامی محیط های کشت ادرار در دمای 37-35 درجه و حداقل برای مدت 18 ساعت انکوبه می شوند تا بهترین رشد باکتری را داشته باشند. محیط های کشت MacConkey و محیط های رنگ زا باید بصورت Overnight و در دمای محیط نگهداری شوند. برای افزایش قدرت رشد باکتری های گرم مثبت محیط بلاد آگار باید در شرایط هوازی حاوی 10-5 % CO2 نگهداری شود. پلیت های Biplate (پلیت هایی که نیمی از آن بلاد آگار و نیمی دیگر یک محیط کشت انتخابی است) می توانند ابتدا در دمای محیط انکوبه شوند و در ادامه برای 18 ساعت در شرایط هوازی با 5% CO2 (جدول 2)

محیط های کشت مربوط به نمونه های ادرار midstream و یا بیماران سنین بالاتر از 65 سال و بیماران بستری و نیز نمونه های گرفته شده توسط کاتترهای ثابت حداقل باید برای 36 ساعت انکوبه شوند. نمونه ادرارهای گرفته شده به روش تهاجمی و نمونه های مشکوک به عفونت ادراری به وسیله عوامل قارچی مدت 42 تا 48 ساعت باید باید انکوبه شوند. هیچ توصیه ای برای انکوباسیون نمونه های ادراری روتین برای مدت بیش ا ز 48 ساعت وجود ندارد.